What is the purpose of the sand layer in column chromatography?

The sand layer, placed 0.5 cm above the cotton plug, prevents silica gel from passing through the plug into your collected fractions. This protective barrier ensures that only the separated dyes are collected in pure fractions, maintaining the integrity of your samples throughout the separation process.

Why does column chromatography use two different eluents for separating food dyes?

Using ethanol first elutes erioglaucine, which has lower affinity for silica gel, while water elutes tartrazine more effectively due to its higher polarity. This two-solvent approach saves time and minimizes solvent waste while maintaining fraction purity, compared to using a single eluent throughout the entire separation.

How do you prepare the silica gel slurry for column chromatography?

Weigh 5 grams of silica gel powder and mix it with 18 mL of 95% ethanol in a beaker. Stir with a glass rod until the texture is consistent and resembles batter with no dry patches or clumps. The slurry should flow easily to avoid clogging the funnel or trapping air bubbles in the column.

What flow rate should you maintain when eluting dyes through the column?

Adjust the stopcock so the solvent level decreases approximately 1 mL every 15 to 20 seconds. Maintain at least 1 cm of solvent above the silica gel at all times by periodically refilling the column. This controlled solvent flow rate ensures proper separation and prevents band broadening during the elution process.

How do you apply the green food dye to the silica gel column?

Use a clean pipette to gently apply 5 to 7 drops of the dye solution evenly across the top of the silica gel. If necessary, add a few drops of ethanol to keep the silica gel covered. Allow the dye to soak in before beginning the elution process with your chosen eluent.

What do the different colors of fractions tell you about dye affinity for silica gel?

The blue erioglaucine elutes with ethanol, indicating lower affinity for silica gel, while yellow tartrazine requires water, indicating higher affinity. This separation demonstrates that tartrazine binds more strongly to silica gel than erioglaucine does, which is why different solvents are needed to elute each dye effectively.

Why is it important to avoid stopping the column chromatography for extended periods?

Stopping for more than 1 minute at a time causes compound bands to start broadening, which reduces separation quality and makes it harder to collect pure fractions. Continuous flow maintains sharp band definition and ensures efficient separation of the dyes throughout the elution process.

Kolon Kromatografisi

Kavramlar Eğitmen Hazırlığı Öğrenci Protokolü

0 görüntüleme03:07 dk

Kolon kromatografisi, bileşikleri, genellikle mikroskobik boncuklar şeklinde olan sabit bir faz ile etkileşimlerine dayalı olarak ayırmak için paketlenmiş bir kolon kullanan bir tekniktir. Boncuklar arasındaki boşluklar çözücü ile doldurulur. Kolonun açılması, çözücünün sabit fazdan akmasına izin verir. Paketlenmiş kolonun tepesine bir karışım uygulandığında ve ardından daha fazla çözücü uygulandığında, karışım mobil faza geçer ve sabit fazdan akar.

Karışımın her bir bileşeni, sabit faz ile farklı bir şekilde etkileşime girer. Bazı bileşenler durağan faz ile zayıf etkileşimlere sahiptir ve bu nedenle kolon boyunca hızlı hareket ederken, diğerleri durağan faz ile güçlü etkileşimlere sahiptir ve bu nedenle daha yavaş hareket eder. Bu, farklı bileşikleri küçük fraksiyonlar halinde toplanan bantlara ayırır. Bu, her bir bileşiğin saflaştırılmasını sağlar.

Peki, karışımları ayırmak için ne tür özellikler kullanılabilir? En sık kullanılan özelliklerden biri polaritedir. Bunun için bir silikon dioksit formu olan silika jel genellikle sabit faz olarak kullanılır. Silika jel, yüzeyinde oluşan -OH grupları aracılığıyla dipol-dipol etkileşimleri ve hidrojen bağı ile bileşiklerle etkileşime girer. Bu nedenle, polar bileşikler durağan faz ile güçlü bir şekilde etkileşime girerken, polar olmayan bileşikler zayıf bir şekilde etkileşime girecektir.

Ayırma için kullanılabilecek diğer özellikler arasında boyut, yük ve hidrofobiklik bulunur. Sabit fazı kolona yüklemenin yaygın bir yolu, sabit faz ve çözücünün bir bulamacıdır. Daha sonra, sabit faz, bulamacı sıkıştırmak için kolondan daha fazla çözücü akıtılarak paketlenir. Sabit fazın hava kabarcıkları, boş kanallar veya kuru lekeler olmadan düzgün bir şekilde paketlenmesi önemlidir. Bunlar akışı bozabilir ve bantların karışmasına neden olabilir.

Bir kolon seçerken, çap ayrılacak numunenin hacmine bağlıdır. Numune, kolonun üst kısmını ince, eşit bir tabaka halinde kaplamalıdır. Daha kalın bir numune tabakası daha geniş bantlara yol açar. Kolon uzunluğu, bileşiklerin sabit fazda ne kadar iyi ayrıldığına bağlıdır. Sabit faz için benzer afiniteye sahip bileşikler, yeterli ayırma için uzun bir kolon gerektirir. Bununla birlikte, durağan faz için çok farklı afinitelere sahip bileşiklerin bir karışımı, daha kısa bir kolon üzerinde ayrılabilir.

Bu laboratuvarda, önce bir silika jel sütunu paketleyip hazırlayarak sütun kromatografisini keşfedeceksiniz. Ardından, yeşil gıda boyasındaki renkli bileşenleri ayırmak için sütununuzu kullanacaksınız.

Print Procedure Steps

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Lara Al Hariri ve Ahmed Basabrain, Massachusetts Amherst Üniversitesi, MA, ABD

Gıda Boyasının Sütun Kromatografisi
Bu deneyde, yeşil gıda boyasını erioglaucine ve tartrazine adı verilen mavi ve sarı boyalara ayırmak için kolon kromatografisini kullanacaksınız. İlk olarak, silika jel için daha zayıf bir afiniteye sahip boyayı çıkarmak için %95 etanol kullanacaksınız. Ardından, ikinci boyayı kolondan suyla yıkayacaksınız. Saflaştırılmış boyaları geri kazanmak için, her bir boya bandını kolondan çıkarken toplayacaksınız. Toplanan bu hacimlere kesirler denir.
- Başlamak için bir laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve bir çift nitril eldiven giyin.
- Merkezi tedarik alanına bir sütun veya büret getirin. Bir parça pamuk veya cam yünü alın ve sütununuzun üstüne bastırın. Vananın hemen üzerindeki sütunu tıkamak için aşağı itmek için uzun, kör uçlu bir tel veya çubuk kullanın. not: Pamuğun stabil olması gerekir, ancak çok yoğun bir şekilde paketlemeyin, çünkü çözücünün içinden kolayca geçmesi gerekir. Musluğun fişe takılmadan serbestçe dönebildiğinden emin olun.
- Bir laboratuvar standına bir büret kelepçesi takın ve sütunu, altında yaklaşık 4 inç boşluk olacak şekilde dik olarak sıkıştırın. Musluğun kapalı olduğundan emin olun.
- 100 mL'lik bir kabı 'atık' olarak etiketleyin ve sütunun altına yerleştirin.
- Ardından, darası alınmış bir tartı teknesinde 1 g kum ölçün ve tezgaha geri getirin.
- Ardından, pamuk tapanın üst kısmının yaklaşık 0,5 cm üzerindeki sütunu işaretleyin.
- Sütunun üst kısmına küçük bir huni yerleştirin ve tapanın üzerinde 0,5 cm derinliğinde bir tabaka olacak şekilde huniden yeterince kum dökün. Bu, silika jelin tapadan fraksiyonlarınıza geçmesini önleyecektir.
- Huniyi çıkarın ve kumu eşit şekilde dağıtmak için sütuna hafifçe vurun.
- Şimdi, eluentlerinizi hazırlayın. 50 mL'lik bir beheri ve 50 mL'lik dereceli bir silindiri 'su' olarak etiketleyin.
- Dereceli silindir ile 50 mL deiyonize suyu ölçün ve behere dökün.
- Ardından, başka bir 50 mL'lik beheri ve 50 mL'lik dereceli bir silindiri 'etanol' olarak etiketleyin. 50 mL% 95 etanol ölçün ve bu kabın içine dökün.
- Şimdi, 4 veya 5 temiz Pasteur pipeti ve bir pipet ampulü edinin. Kolonun iç duvarları boyunca 7 – 8 mL etanolü nazikçe pipetleyin. Bu çözücü tabakası, kumu rahatsız etmeden bu silika jel bulamacını kolona dökmenize izin verecektir.
- Vanayı açın ve vanadan havayı boşaltmak ve solventin tapadan kolayca aktığını doğrulamak için ~1 mL etanolü atık behere boşaltın. Kumda ve tapada kuru leke olmadığından emin olun ve sıkışan hava kabarcıklarını çıkarmak için sütunun yan tarafına hafifçe vurun.
- Ardından, sütunun üst kısmına temiz bir huni yerleştirin ve üçüncü bir 50 mL'lik beheri 'etanolde silika jel bulamacı' olarak etiketleyin.
- 5 g silika jel tozunu dikkatlice tartın ve etiketli beherinize dökün.
- Ardından, silika jeli, bir cam çubuğu ve etanol dereceli silindirinizi etanol dağıtım başlığına getirin.
- 18 mL %95 etanol ölçün ve kabın içine dökün. Doku tutarlı olana ve kuru lekeler veya toz topakları kalmayana kadar karışımı cam çubukla karıştırın. Bu genellikle ~ 1 dakika sürer. Not: Bulamaç, meyilli gibi kalın olmalı, ancak yine de kolayca akmalıdır. Bulamaç çok sertse, huniyi tıkayabilir veya kolondaki hava kabarcıklarını sıkıştırabilir.
- Toz etanolde tamamen süspanse edildiğinde, tezgahınıza getirin. Bulamacı dokusu tekrar tutarlı olana kadar karıştırın ve hemen sütuna dökün.
- Hava kabarcıklarından kurtulmak için silika jel yerleşirken sütunun kenarlarına hafifçe vurun.
- Beheri 1 veya 2 mL etanol ile durulayın ve durulamayı kolona dökün. Ardından, huniyi çıkarın ve bir kenara koyun.
- Duvarlara yapışmış parçacıkları yıkamak için kolonun iç kısmına etanol pipetleyin. Ardından, menisküs silika jelin üst kısmının hemen üzerine gelene kadar çözücüyü boşaltın.
- Şimdi, yaklaşık 0,8 mL yeşil gıda boyası çözeltisi elde etmek için 5 veya 10 mL dereceli bir silindir kullanın.
- Silika jelin üst kısmına 5 ila 7 damla boya solüsyonunu nazikçe uygulamak için temiz bir pipet kullanın. Gerekirse, silika jeli kapalı tutmak için birkaç damla etanol ekleyin.
- Boyanın emilmesini beklerken, iki temiz 50 mL'lik kabı 'etanol fraksiyonu' ve 'su fraksiyonu' olarak etiketleyin. Kolonun altındaki atık kabı etanol fraksiyon kabı ile değiştirin.
- Ardından, silika jeli rahatsız etmemek için sütunu etanol ile doldurun ve ilk mL'yi iç duvarlar boyunca pipetleyin.
- Ardından, musluğu kısmen açın ve solvent seviyesi her 15 – 20 saniyede bir ~1 mL düşene kadar ayarlayın.
- Etanolün akmasını sağlamak için sütunu periyodik olarak yeniden doldurun. Silika jelin üzerinde her zaman en az 1 cm çözücü olduğundan emin olun.
- Sarı ve mavi bantları ayrılırken izleyin. not: Uzaklaşmanız gerekiyorsa, siz yokken sütunun kurumaması için vanayı kapatın. Bileşik bantlar genişlemeye başlayacağından bir seferde 1 dakikadan fazla durmaktan kaçının. Daha hızlı hareket eden boyanın kolondan ayrılması genellikle yaklaşık 20 – 35 dakika sürer.
- Etanol fraksiyon beherindeki tüm hızlı hareket eden boyayı topladıktan sonra, musluğu kapatın, etanol fraksiyonunu bir kenara koyun ve atık beheri sütunun altına koyun.
- Menisküs silika jelin üst kısmının hemen üzerine gelene kadar çözücüyü boşaltın. Ardından, atık kabı su fraksiyonu kabı ile değiştirin.
- Sütunun üst kısmını deiyonize suyla doldurmak için temiz bir pipet kullanın. Ardından, musluğu her 15 – 20 saniyede bir yaklaşık 1 mL hızında suyun kolondan akmasına izin verecek kadar açın.
- İkinci renk bandı sütunu tamamen terk edene kadar sütunu gerektiği kadar suyla doldurun. Bu genellikle 15 – 25 dakika daha sürer. Ardından, vanayı kapatın ve su fraksiyonu kabını atık beher ile değiştirin.
- Şimdi, sütunu tamamen boşaltın ve musluğu açık bırakın.
- Etanol ve su fraksiyonlarının renklerini laboratuvar defterinize kaydedin.
  Tablo 1: Gıda Boyasının Kolon Kromatografisi
  
  Renk Hacim (mL)
  Etanol fraksiyonu
  Su fraksiyonu
  Tablo 1'i indirmek için buraya tıklayın
- Fraksiyonları karşılık gelen 50 mL dereceli silindirlere dökün ve her fraksiyonun hacmini kaydedin. Ardından, vanayı kapatın ve sütunu bir çeker ocak haline getirin.
- Silika jelin kuruması için sütunu davlumbazda dik olarak sıkıştırın. Eğitmeniniz size ya sütunu nasıl temizleyeceğinizi söyleyecek ya da laboratuvardan sonra ona nasıl bakacağınızı söyleyecektir.
- Şimdi, toplanan fraksiyonları ve kalan etanol, su ve boya solüsyonunu kanalizasyona yıkayın ve cam eşyalarınızın geri kalanını her zamanki gibi temizleyin.
- Kullanılmış Pasteur pipetlerini cam çöpüne atın. Kullanılmış kağıt havluları ve tartı teknesini laboratuvar çöpüne atın ve ayrılmadan önce tezgahı temizleyin.
Results
Bu deneyde, etanolün mavi erioglausini zamanında boşalttığını gördünüz, ancak sarı tartrazin için etkili bir eluent değildi. Yeşil boyanın kağıt kromatografisi de benzer sonuçlar göstermektedir. Bu nedenle, erioglausinin silika jel için tartrazinden daha düşük bir afiniteye sahip olduğu sonucuna varıyoruz.

Şimdi, boyayı ayrı ayrı elüte etmek için iki çözücü kullanmanın avantajlarını düşünün. Su, etanolden daha polardır, bu nedenle her iki boyayı da tek başına etanolden daha hızlı bir şekilde ayrıştıracağını varsayıyoruz. Sadece su kullanmış olsaydınız genel olarak daha az çözücü kullanmış olsanız da, ayırma daha kötü olurdu ve saf fraksiyonların toplanmasını zorlaştırırdı.

Alternatif olarak, erioglaucine topladıktan sonra etanol kullanmaya devam edebilirdiniz, ancak tartrazini bu şekilde çıkarmak uzun zaman ve çok fazla etanol alacaktı. Erioglaucine ayrıştırıldıktan sonra eluentin suya geçirilmesi zamandan tasarruf sağladı ve saflıktan ödün vermeden solvent israfını en aza indirdi.