16.12:

16.12: Yerinde Hibridizasyon

In-situ Hybridization

JoVE Core
Molecular Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Core Molecular Biology

In-situ Hybridization

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

16.11: Reporter Genes

16.13: Chromatin Immunoprecipitation- ChIP

9,145 Views

•

02:31 min

•

April 07, 2021

Overview

İn situ hibridizasyon (ISH), etiketli bir prob kullanarak hücreler, doku veya doku bölümlerindeki spesifik DNA veya RNA moleküllerini tespit etmek ve lokalize etmek için kullanılan bir tekniktir. Teknik ilk olarak 1969’da nükleik asitlerin araştırılması için kullanıldı. Şu anda bilimsel araştırma ve klinik ortamlarda, özellikle teşhis amaçlı önemli bir araçtır.

Prob ve etiket türleri

Bir prob, bir hücredeki karşılık gelen nükleotid dizilerine bağlanan tamamlayıcı bir DNA veya RNA zinciridir. Tek sarmallı DNA probları, çift sarmallı DNA probları, antisens RNA probları veya riboproblar ve sentetik oligodeoksinükleotid probları gibi birçok farklı prob, in situ hibridizasyonda kullanılır. Prob seçimi, duyarlılıkları, özgüllükleri, stabiliteleri ve doku örneğine nüfuz etme kolaylığı dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır.

Bu problar, tespit amacıyla radyoizotoplar, floresan boyalar veya diğer antijen molekülleri ile etiketlenebilir. ³H, ³⁵S ve ³²P yaygın olarak kullanılan radyoaktif işaretli problardır, radyoaktif olmayan etiketler ise biotin, digoksigenin ve floresein içerir. Bu etiketler, prob DNA molekülüne uç etiketleme, nick çevirisi veya rastgele primer sentez yöntemleri ile eklenebilir. Otoradyografi, floresan mikroskobu veya immünohistokimya gibi tespit yöntemleri, hibritleştirilmiş proba iliştirilen etikete dayalı olarak hedef görselleştirme için kullanılır.

Yerinde hibridizasyonun avantajları ve dezavantajları

İn situ hibridizasyonun en büyük avantajlarından biri, elde edilmesi zor olan dokuların maksimum kullanımını sağlamak için donmuş dokulara bile uygulanabilmesidir. Ek olarak, numunedeki protein ve aktif mRNA’yı tespit etmek için immünohistokimya gibi diğer tekniklerle birleştirilebilir. Bununla birlikte, düşük DNA ve RNA kopyalarına sahip numunelerle çalışırken, yerinde hibridizasyon kullanarak hedefleri belirlemek zor olabilir.

Transcript

İn situ hibridizasyon, kültürlenmiş hücrelerde veya kimyasal olarak korunmuş doku bölümlerinde DNA veya RNA’yı bulmak için kullanılan bir tekniktir.

RNA in situ hibridizasyonu, spesifik mRNA transkriptlerini tespit ederek ve nicelleştirerek bir genin nerede ifade edildiğini izlemek için kullanılır.

Hedef mRNA’lar, bir DNA şablonunun in vitro transkripsiyonu ile oluşturulan veya bir kimyasal reaksiyonla sentezlenen tek sarmallı, tamamlayıcı RNA probları ile tespit edilir.

Problar, radyoaktif izotoplar, floroforlar veya etiketli bir antikor tarafından bağlanabilen ve tespit edilebilen biyotin veya digoksijenenin gibi diğer raportör moleküller ile etiketlenir.

RNA in situ hibridizasyonunun dört ana adımı vardır: doku fiksasyonu, geçirgenleştirme, hibridizasyon ve tespit.

Başlamak için, doku içindeki herhangi bir biyokimyasal reaksiyonu durdurmak ve yapısal bütünlüğünü korumak için taze doku toplanır ve kimyasal olarak işlenir. Bu koruma tekniğine doku fiksasyonu denir.

Daha sonra, probun hedef RNA’ya erişmesi ve bağlanması için dokudaki proteinlerin ve lipitlerin çıkarılması gerekir.

Proteinleri parçalamak ve hücre zarına nüfuz etmek için numune, 0.2 molar hidroklorik asit ve proteinazlar gibi enzimler ile muamele edilirken, lipitleri parçalamak için deterjanlar kullanılır.

Hedef RNA daha sonra RNA-prob hibritinin erime noktasının hemen altındaki bir sıcaklıkta problarla hibritlenir. Bu, probların tamamlayıcı mRNA’larla tavlanmasına yardımcı olur. Bağlanmamış ve gevşek bağlı problar birkaç yıkama yapılarak çıkarılır.

Hibritleştirilmiş probları tespit etme yöntemi, etiketin türüne bağlıdır. Radyoaktif problar fotoğraf filmlerine maruz bırakılırken, floresan problar floresan mikroskoplar altında görülebilir.

Diğer etiketler için, raportör moleküle karşı antikorlar bir floresan veya kolorimetrik boya ile etiketlenir.

Hibritleştirilmiş probların tespiti, ilgilenilen genlerin nerede ifade edildiğini gösteren spesifik mRNA’ların dağılımını ortaya çıkarır.

Key Terms and definitions

Learning Objectives

Questions that this video will help you answer

This video is also useful for