5.12

In situ hibridizasyon

9.5K views02:31 min

İn situ hibridizasyon, kültürlenmiş hücrelerde veya kimyasal olarak korunmuş doku bölümlerinde DNA veya RNA'yı bulmak için kullanılan bir tekniktir.

RNA in situ hibridizasyonu, spesifik mRNA transkriptlerini tespit ederek ve nicelleştirerek bir genin nerede ifade edildiğini izlemek için kullanılır.

Hedef mRNA'lar, bir DNA şablonunun in vitro transkripsiyonu ile oluşturulan veya bir kimyasal reaksiyonla sentezlenen tek sarmallı, tamamlayıcı RNA probları ile tespit edilir.

Problar, radyoaktif izotoplar, floroforlar veya etiketli bir antikor tarafından bağlanabilen ve tespit edilebilen biyotin veya digoksijenenin gibi diğer raportör moleküller ile etiketlenir.

RNA in situ hibridizasyonunun dört ana adımı vardır: doku fiksasyonu, geçirgenleştirme, hibridizasyon ve tespit.

Başlamak için, doku içindeki herhangi bir biyokimyasal reaksiyonu durdurmak ve yapısal bütünlüğünü korumak için taze doku toplanır ve kimyasal olarak işlenir. Bu koruma tekniğine doku fiksasyonu denir.

Daha sonra, probun hedef RNA'ya erişmesi ve bağlanması için dokudaki proteinlerin ve lipitlerin çıkarılması gerekir.

Proteinleri parçalamak ve hücre zarına nüfuz etmek için numune, 0.2 molar hidroklorik asit ve proteinazlar gibi enzimler ile muamele edilirken, lipitleri parçalamak için deterjanlar kullanılır.

Hedef RNA daha sonra RNA-prob hibritinin erime noktasının hemen altındaki bir sıcaklıkta problarla hibritlenir. Bu, probların tamamlayıcı mRNA'larla tavlanmasına yardımcı olur. Bağlanmamış ve gevşek bağlı problar birkaç yıkama yapılarak çıkarılır.

Hibritleştirilmiş probları tespit etme yöntemi, etiketin türüne bağlıdır. Radyoaktif problar fotoğraf filmlerine maruz bırakılırken, floresan problar floresan mikroskoplar altında görülebilir.

Diğer etiketler için, raportör moleküle karşı antikorlar bir floresan veya kolorimetrik boya ile etiketlenir.

Hibritleştirilmiş probların tespiti, ilgilenilen genlerin nerede ifade edildiğini gösteren spesifik mRNA'ların dağılımını ortaya çıkarır.

Overview

Loading...

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In situ hibridizasyon (ISH), etiketli bir prob kullanarak hücreler, doku veya doku bölümlerindeki spesifik DNA veya RNA moleküllerini tespit etmek ve lokalize etmek için kullanılan bir tekniktir. Teknik ilk kez 1969'da nükleik asitlerin araştırılmasında kullanıldı. Şu anda bilimsel araştırma ve klinik ortamlarda, özellikle teşhis amaçlı, önemli bir araçtır.

Prob ve etiket türleri

Prob, bir hücredeki karşılık gelen nükleotit dizilerine bağlanan tamamlayıcı bir DNA veya RNA dizisidir. Tek sarmallı DNA probları, çift sarmallı DNA probları, antisens RNA probları veya riboproblar ve sentetik oligodeoksinükleotit probları gibi birçok farklı prob, in situ hibridizasyonda kullanılır. Probun seçimi hassasiyeti, özgüllüğü, stabilitesi ve doku örneğine nüfuz etme kolaylığı gibi çeşitli faktörlere bağlıdır.

Bu problar, tespit amacıyla radyoizotoplar, floresan boyalar veya diğer antijen molekülleri ile etiketlenebilir. 3H, 35S ve 32P yaygın olarak kullanılan radyoaktif etiketli problardır; radyoaktif olmayan etiketler ise biyotin, digoksigenin ve fluoresein içerir. Bu etiketler, end-labeling (uç etiketleme), nick translasyonu veya rastgele primer sentezi yöntemleri yoluyla prob DNA molekülüne eklenebilir. Otoradyografi, floresan mikroskobu veya immünohistokimya gibi tespit yöntemleri, hibridize proba yapıştırılan etikete dayalı olarak hedef görselleştirme için kullanılır.

In situ hibridizasyonun avantajları ve dezavantajları

In situ hibridizasyonun en büyük avantajlarından biri, elde edilmesi zor olan dokuların maksimum kullanımını sağlamak için dondurulmuş dokulara bile uygulanabilmesidir. Ayrıca numunedeki proteini ve aktif mRNA'yı tespit etmek için immünohistokimya gibi diğer tekniklerle birleştirilebilir. Ancak düşük DNA ve RNA kopyalarına sahip örneklerle çalışırken in situ hibridizasyon kullanılarak hedeflerin belirlenmesi zor olabilir.

Transcript

Loading...

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İn situ hibridizasyon, kültürlenmiş hücrelerde veya kimyasal olarak korunmuş doku bölümlerinde DNA veya RNA'yı bulmak için kullanılan bir tekniktir.

RNA in situ hibridizasyonu, spesifik mRNA transkriptlerini tespit ederek ve nicelleştirerek bir genin nerede ifade edildiğini izlemek için kullanılır.

Hedef mRNA'lar, bir DNA şablonunun in vitro transkripsiyonu ile oluşturulan veya bir kimyasal reaksiyonla sentezlenen tek sarmallı, tamamlayıcı RNA probları ile tespit edilir.

Problar, radyoaktif izotoplar, floroforlar veya etiketli bir antikor tarafından bağlanabilen ve tespit edilebilen biyotin veya digoksijenenin gibi diğer raportör moleküller ile etiketlenir.

RNA in situ hibridizasyonunun dört ana adımı vardır: doku fiksasyonu, geçirgenleştirme, hibridizasyon ve tespit.

Başlamak için, doku içindeki herhangi bir biyokimyasal reaksiyonu durdurmak ve yapısal bütünlüğünü korumak için taze doku toplanır ve kimyasal olarak işlenir. Bu koruma tekniğine doku fiksasyonu denir.

Daha sonra, probun hedef RNA'ya erişmesi ve bağlanması için dokudaki proteinlerin ve lipitlerin çıkarılması gerekir.

Proteinleri parçalamak ve hücre zarına nüfuz etmek için numune, 0.2 molar hidroklorik asit ve proteinazlar gibi enzimler ile muamele edilirken, lipitleri parçalamak için deterjanlar kullanılır.

Hedef RNA daha sonra RNA-prob hibritinin erime noktasının hemen altındaki bir sıcaklıkta problarla hibritlenir. Bu, probların tamamlayıcı mRNA'larla tavlanmasına yardımcı olur. Bağlanmamış ve gevşek bağlı problar birkaç yıkama yapılarak çıkarılır.

Hibritleştirilmiş probları tespit etme yöntemi, etiketin türüne bağlıdır. Radyoaktif problar fotoğraf filmlerine maruz bırakılırken, floresan problar floresan mikroskoplar altında görülebilir.

Diğer etiketler için, raportör moleküle karşı antikorlar bir floresan veya kolorimetrik boya ile etiketlenir.

Hibritleştirilmiş probların tespiti, ilgilenilen genlerin nerede ifade edildiğini gösteren spesifik mRNA'ların dağılımını ortaya çıkarır.