5.15
Ribozom Profiling
Ribozom profiling veya ribo dizileme, bir hücredeki aktif translasyonun anlık görüntüsünü üreten derin bir dizileme tekniğidir. Herhangi bir zamanda b…
Bir genomda kopyalanan ve proteinlere çevrilen bölgelerin tanımlanması, bir genomu ve ekspresyonunu anlamada hayati bir adımdır.
Bu, ribozom profillemesi adı verilen ve aynı zamanda ribo-seq olarak da adlandırılan bir teknikle elde edilir. Ribozomların mRNA üzerindeki konumlarını haritalandırır ve aktif olarak proteinlere çevrilen mRNA'ları tanımlar.
RNA'yı izole etmek için, hücrelerin önce içlerindeki moleküllere erişmek için parçalanması gerekir. Lizat daha sonra RNazlar ile muamele edilir. Bu enzimler, ribozomlarla kaplı olmayan mRNA'ları parçalayarak geriye sadece korunan mRNA fragmanları kalır.
Ribozom korumalı fragmanlar daha sonra bir sakaroz gradyanı kullanılarak korumasız, parçalanmış fragmanlardan ayrılır.
Ribozomlar daha sonra mRNA fragmanlarından çıkarılır ve RNA, ters transkriptaz enzimi kullanılarak RT-PCR ile DNA'ya dönüştürülür.
Daha sonra, DNA dizilenir ve referans genom üzerinde haritalanır. Bu, her mRNA boyunca ribozomun tam yerini belirler.
Ribozom profili oluşturma, tanınmayan açık okuma çerçevelerini veya ORF'leri tanımlamaya da yardımcı olabilir. Bir ORF, proteine çevrilebilen bir başlangıç kodonu ile bir durdurma kodonu arasındaki bir DNA bölgesidir. ORF'lerin bulunması, yeni genlerin tanımlanmasında yardımcı olabilir.
Bir memeli hücre hattındaki gen ekspresyon modellerinin incelenmesini düşünün. Deneysel prosedür, hücrelerin gen ekspresyonunu açabilecek ve mRNA sentezini başlatabilecek uyaranlara maruz bırakılmasını içerir.
Aktif olarak çevrilen mRNA'lar, ribozom profillemesi kullanılarak tanımlanır.
Bu deney, B geninin translasyona uğradığını, A ve C genlerinin ise translasyona tabi olmadığını ortaya koymaktadır.
Ayrıca, genomun yaklaşık yüz nükleotid uzunluğundaki ek küçük bir bölgesinin aktif olarak çevrildiğini gösteriyor.
Bu tanınmayan bölge, deneysel uyaranlar tarafından yukarı regüle edilen yeni bir proteini kodlayabilen açık bir okuma çerçevesidir.
View the full transcript and gain access to JoVE Core videos
Q1: What is ribosome profiling and what does it measure?
Ribosome profiling, also called ribo-seq, is a deep sequencing technique that maps ribosome positions on mRNA to identify actively translated genes. It produces a snapshot of the translation landscape in a cell at any given moment by selectively sequencing mRNAs protected by ribosomes, revealing which genes are being translated into proteins.
Q2: How does ribosome profiling isolate and protect mRNA fragments?
Cells are lysed to access internal molecules, then the lysate is treated with RNases that cleave unprotected mRNAs. Ribosomes shield their bound mRNA from cleavage, leaving only ribosome-protected fragments. These protected fragments are then separated from cleaved fragments using a sucrose gradient for further analysis.
Q3: What role do open reading frames play in ribosome profiling analysis?
Ribosome profiling identifies open reading frames (ORFs), which are DNA regions between start and stop codons that can be translated into proteins. Discovering unrecognized ORFs helps identify new genes and novel proteins. In experimental studies, ribosome profiling can reveal previously unknown translated regions upregulated by specific cellular stimuli.
Q4: How is ribosomal RNA contamination addressed in ribosome profiling?
Ribosomal RNA (rRNA) that binds to mRNA is typically removed during ribosome profiling. However, rRNA contaminants sometimes persist. Researchers use the duplex-specific nuclease (DSN) enzyme, isolated from the Kamchatka crab hepatopancreas, which cleaves dsDNA and DNA-RNA hybrids to reduce rRNA contamination in samples.
Q5: What technical challenges does ribosome profiling face?
Ribosome profiling requires large sample amounts, timely translation inhibition, and managing RNA contamination. Flash-freezing efficiently captures ribosome distribution compared to elongation inhibitors like cycloheximide. Data analysis also demands bioinformatics expertise; the riboSeqR R package helps overcome this limitation by providing methods for resolving profiling data across multiple samples.
Q6: How does ribosome profiling convert mRNA to DNA for sequencing?
After ribosomes are removed from protected mRNA fragments, the RNA is converted into DNA using reverse transcriptase through RT-PCR. The resulting DNA is then sequenced and mapped onto a reference genome to determine the exact ribosome location along each mRNA molecule.
Q7: What applications does ribosome profiling have in studying gene expression?
Ribosome profiling enables in vivo monitoring of translation in specific organs or tissues and quantifies new protein synthesis levels. It discovers translated products including short peptides and protein isoforms with unknown functions. The technique also identifies mRNAs that remain untranslated until receiving external signals, revealing dynamic translation regulation.