Ribozom Profiling

Bir genomda kopyalanan ve proteinlere çevrilen bölgelerin tanımlanması, bir genomu ve ekspresyonunu anlamada hayati bir adımdır.

Bu, ribozom profillemesi adı verilen ve aynı zamanda ribo-seq olarak da adlandırılan bir teknikle elde edilir. Ribozomların mRNA üzerindeki konumlarını haritalandırır ve aktif olarak proteinlere çevrilen mRNA'ları tanımlar.

RNA'yı izole etmek için, hücrelerin önce içlerindeki moleküllere erişmek için parçalanması gerekir. Lizat daha sonra RNazlar ile muamele edilir. Bu enzimler, ribozomlarla kaplı olmayan mRNA'ları parçalayarak geriye sadece korunan mRNA fragmanları kalır.

Ribozom korumalı fragmanlar daha sonra bir sakaroz gradyanı kullanılarak korumasız, parçalanmış fragmanlardan ayrılır.

Ribozomlar daha sonra mRNA fragmanlarından çıkarılır ve RNA, ters transkriptaz enzimi kullanılarak RT-PCR ile DNA'ya dönüştürülür.

Daha sonra, DNA dizilenir ve referans genom üzerinde haritalanır. Bu, her mRNA boyunca ribozomun tam yerini belirler.

Ribozom profili oluşturma, tanınmayan açık okuma çerçevelerini veya ORF'leri tanımlamaya da yardımcı olabilir. Bir ORF, proteine çevrilebilen bir başlangıç kodonu ile bir durdurma kodonu arasındaki bir DNA bölgesidir. ORF'lerin bulunması, yeni genlerin tanımlanmasında yardımcı olabilir.

Bir memeli hücre hattındaki gen ekspresyon modellerinin incelenmesini düşünün. Deneysel prosedür, hücrelerin gen ekspresyonunu açabilecek ve mRNA sentezini başlatabilecek uyaranlara maruz bırakılmasını içerir.

Aktif olarak çevrilen mRNA'lar, ribozom profillemesi kullanılarak tanımlanır.

Bu deney, B geninin translasyona uğradığını, A ve C genlerinin ise translasyona tabi olmadığını ortaya koymaktadır.

Ayrıca, genomun yaklaşık yüz nükleotid uzunluğundaki ek küçük bir bölgesinin aktif olarak çevrildiğini gösteriyor.

Bu tanınmayan bölge, deneysel uyaranlar tarafından yukarı regüle edilen yeni bir proteini kodlayabilen açık bir okuma çerçevesidir.