16.15: Ribozom Profili Oluşturma

Ribozom profili oluşturma veya ribo dizileme, bir hücredeki aktif translasyonun anlık görüntüsünü üreten derin bir dizileme tekniğidir. Ribozomlar tarafından korunan mRNA’ları, herhangi bir zamanda bir hücrenin çeviri manzarası hakkında bir fikir edinmek için seçici olarak sıralar.

Ribozom profilleme uygulamaları

Ribozom profillemesi, belirli bir organ veya doku tipi içindeki translasyonun in vivo izlenmesi ve yeni protein sentezi seviyelerinin ölçülmesi dahil olmak üzere birçok uygulamaya sahiptir.

Teknik, çevrilmiş açık okuma çerçevelerini tanımlamaya ve kısa peptitler ve bilinmeyen işlevlere sahip karakterize edilmiş proteinlerin izoformları dahil olmak üzere yeni çevrilmiş ürünleri keşfetmeye yardımcı olur. Ribozom profillemesi ayrıca hücrede harici bir sinyal alana kadar çevrilmeyen birkaç mRNA’nın tanımlanmasına da yardımcı olur.

Ribozom Profillemenin teknik zorlukları

Ribozom profillemesi, büyük miktarlarda numune gereksinimi, translasyonun zamanında engellenmesine bağımlılık ve RNA kontaminasyonu gibi birçok teknik zorlukla karşı karşıyadır.

Flaş dondurma tekniği, hızlı translasyon inhibisyonu zorluğunun üstesinden gelebilir. Sikloheksimid gibi translasyon uzaması inhibitörlerine kıyasla hücreler içindeki ribozom dağılımını verimli bir şekilde yakalamaya yardımcı olur.

mRNA’ya bağlanan ribozomal RNA (rRNA) genellikle ribozom profillemesi sırasında çıkarılır. Bununla birlikte, bazen birkaç rRNA kirleticisi hala gözlenmektedir. Araştırmacılar, Kamçatka yengecinin hepatopankreasından izole edilen ve dsDNA ve DNA-RNA hibritlerini parçalayan rRNA kontaminasyonunu azaltmak için dubleks spesifik nükleaz (DSN) enzimini kullanıyorlar. Bu yöntem genellikle yeni nesil dizilemeden ve rRNA’nın RNA-seq kütüphanelerinden tükenmesinden önce cDNA kütüphanelerini normalleştirmek için de kullanılır.

Ribozom profillemesinin bir başka sınırlaması, biyoinformatikte doğru uzmanlığı gerektiren verilerin analiz edilmesidir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, birden fazla örnek için ribozomal profil oluşturma verilerini çözmek için yöntemler sağlayan bir R paketi riboSeqR kullanılır.