32.8: Kolon Kromatografisinin Prensipleri

Kromatografi tekniği ilk olarak 1901 yılında bir Rus botanikçi olan Michael S. Tswett tarafından organik çözücüler kullanarak bitki pigmentlerini ayırmak için icat edildi. Ayrıca, 1941'de Okçu John Porter Martin ve RLM Synge, silika jeli bir sütuna paketleyerek tekniği değiştirdi. Daha sonra mobil faz olarak kloroform ve su karışımı kullanılarak paketlenmiş kolon üzerinde bir amino asit karışımı ayrıldı. Bu, kolon kromatografisi ile ilgili ilk rapordu. Şu anda, kolon kromatografisi, çeşitli türdeki bileşikleri bir numune karışımından ayırmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir.

Proteinlerin Verimli Bir Şekilde Ayrılmasını Etkileyen Faktörler

Kolon malzemesi, salmastra ve akış hızları ve sıcaklık gibi operasyonel koşullar gibi çeşitli parametreler, kolon kromatografisi ile ayırma verimliliğini belirler.

Kolon malzemesi veya matris seçimi, numune ile etkileşimin kapsamını belirler. Matris malzemesi kolonda sıkı ve düzgün bir şekilde paketlenmelidir. Hava kabarcıkları, döküntüler, büyük parçacıklar ve çökeltiler, çözücünün kolon boyunca düzgün akışına müdahale ederek ayırma verimliliğini etkiler. Sütun ayrıca partikül maddelerden arındırılmış olmalıdır.

Kolona enjekte edilen numune berrak olmalı ve kolonu tıkayarak solvent akışını engelleyebilecek agregalardan arındırılmış olmalıdır. Çözücünün akış hızı da ayrılmayı etkiler. Çözücülerin çok yüksek veya çok düşük akış hızları, bileşiklerin ve saf olmayan preparatların verimsiz bir şekilde ayrılmasına neden olur. Çok yüksek oranlar da kolon salmastrasını bozarak proses verimliliğini etkileyebilir. Ek olarak, elüsyon tamponunun bileşimi de önemli bir faktördür. Yerinde çökelmeyi veya çözünmeyi önlemek için aşındırıcı olmamalı ve numune ve ayrıca kolon malzemesi ile uyumlu olmalıdır.

Başka bir operasyonel parametre olan sıcaklık da proseste önemli bir rol oynar. Numunenin, kolon malzemesinin ve çözücü tamponunun stabilitesine karar verir. Ayrıca, kolon boyunca sabit bir sıcaklık, bileşikleri verimli bir şekilde çözer. Ayırma işlemi tamamlandıktan sonra, daha sonraki çalışmalarda numune kontaminasyonunu önlemek için kolonlar tekrar tekrar uygun bir çözücü geçirilerek iyice yıkanmalıdır. Bazen, tıkanmış herhangi bir malzemeyi çıkarmak için çözücü ters yönde bir kolondan geçirilir.

Sınırlama

Çok yaygın olarak kullanılan bir teknik olmasına rağmen, yöntemin hala bazı sınırlamaları vardır. Bileşiklerin daha iyi çözülmesi için akış hızlarının daha yavaş olması gerektiğinden çok zaman alan bir yöntemdir. Ayrıca, mobil fazda gerekli olan büyük miktarlarda yüksek saflıkta çözücüler, işlemi pahalı hale getirir. Bu aynı zamanda, daha yüksek saf bileşik verimine ihtiyaç duyulduğunda ölçeklendirme maliyetini de artırır.

Kolon kromatografisi, bileşikleri fiziksel ve kimyasal özelliklerine göre ayırmak için kullanılan biyokimyasal bir tekniktir.

İki ana bileşeni vardır - katı, sabit faz veya matris ve sıvı, mobil faz veya çözücü.

Matris dolgulu kolon, protein karışımı gibi bir numune ile yüklenir. Çözücü daha sonra numuneyi kolon boyunca taşımak için kullanılır.

Kolonun içinde matris, proteinleri boyutlarına veya matris ile etkileşimlerine göre filtreleyen moleküler bir ağ görevi görür. Daha büyük proteinler, daha küçük proteinlerden daha hızlı hareket etme eğilimindedir ve bu da boyuta dayalı bir ayrılmaya neden olur.

Ek olarak, bir numunedeki proteinler matris ile etkileşime girebilir. Zayıf etkileşimler proteinlerin hızlı bir şekilde geçmesine izin verirken, güçlü etkileşimler proteinleri sütun içinde tutar.

Çözücünün pH veya iyonik kuvvetindeki kademeli bir değişiklik, proteinlerin matris ile etkileşimlerini değiştirir ve proteinlerin ayrı fraksiyonlara ayrılmasına yardımcı olur.