32.8: Kolon Kromatografisinin Prensipleri

Kromatografi tekniği ilk olarak 1901 yılında Rus botanikçi Michael S. Tswett tarafından organik çözücüler kullanarak bitki pigmentlerini ayırmak için icat edildi. Ayrıca, 1941'de Archer John Porter Martin ve R.L.M. Synge, silika jeli bir sütuna paketleyerek tekniği değiştirdiler. Daha sonra, mobil faz olarak kloroform ve su karışımı kullanılarak paketlenmiş kolon üzerinde bir amino asit karışımı ayrıldı. Bu kolon kromatografisine ilişkin ilk rapordu. Günümüzde kolon kromatografisi, bir numune karışımından çeşitli türdeki bileşikleri ayırmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir.

Proteinlerin Verimli Ayrışmasını Etkileyen Faktörler

Kolon malzemesi, paketleme gibi çeşitli parametreler ve akış hızları ve sıcaklık gibi çalışma koşulları, kolon kromatografisi ile ayrışma verimliliğini belirler.

Kolon malzemesi veya matriks seçimi, numuneyle etkileşimin boyutunu belirler. Matriks malzemesi kolonda sıkı ve düzgün bir şekilde paketlenmelidir. Hava kabarcıkları, döküntüler, büyük parçacıklar ve çökeltiler, solventin kolon boyunca düzgün akışına müdahale ederek ayırma verimliliğini etkiler. Sütun ayrıca partikül maddeden arındırılmış olmalıdır.

Kolona enjekte edilen numune berrak olmalı ve kolonu tıkayarak solvent akışını engelleyebilecek topaklardan arınmış olmalıdır. Çözücünün akış hızı da ayırmayı etkiler. Çözücülerin çok yüksek veya çok düşük akış hızları, bileşiklerin ve saf olmayan preparatların verimsiz ayrılmasına neden olur. Çok yüksek oranlar aynı zamanda kolon paketlemesini de bozarak proses verimliliğini etkileyebilir. Ayrıca elüsyon tamponunun bileşimi de önemli bir faktördür. Yerinde çökelmeyi veya çözünmeyi önlemek için aşındırıcı olmamalı ve numuneyle ve ayrıca kolon malzemesiyle uyumlu olmalıdır.

Bir diğer operasyonel parametre olan sıcaklık da süreçte önemli bir rol oynar. Numunenin, kolon malzemesinin ve solvent tamponunun stabilitesine karar verir. Ayrıca kolon boyunca sabit bir sıcaklık, bileşikleri verimli bir şekilde çözer. Ayırma işlemi tamamlandıktan sonra, sonraki işlemlerde numunenin kontaminasyonunu önlemek için kolonların uygun bir solventten tekrar tekrar geçirilerek iyice yıkanması gerekir. Bazen, tıkanmış herhangi bir malzemeyi çıkarmak için solvent ters yönde bir sütundan geçirilir.

Sınırlamalar

Çok yaygın olarak kullanılan bir teknik olmasına rağmen yöntemin hala bazı sınırlamaları vardır. Bileşiklerin daha iyi çözülmesi için akış hızlarının daha yavaş olması gerektiğinden, bu çok zaman alıcı bir yöntemdir. Ayrıca, hareketli fazda gerekli olan yüksek miktarda saf çözücülerin büyük miktarları, işlemi pahalı hale getirir. Bu aynı zamanda daha yüksek saf bileşik verimine ihtiyaç duyulduğunda ölçek büyütme maliyetini de artırır.

Kolon kromatografisi, bileşikleri fiziksel ve kimyasal özelliklerine göre ayırmak için kullanılan biyokimyasal bir tekniktir.

İki ana bileşeni vardır - katı, sabit faz veya matris ve sıvı, mobil faz veya çözücü.

Matris dolgulu kolon, protein karışımı gibi bir numune ile yüklenir. Çözücü daha sonra numuneyi kolon boyunca taşımak için kullanılır.

Kolonun içinde matris, proteinleri boyutlarına veya matris ile etkileşimlerine göre filtreleyen moleküler bir ağ görevi görür. Daha büyük proteinler, daha küçük proteinlerden daha hızlı hareket etme eğilimindedir ve bu da boyuta dayalı bir ayrılmaya neden olur.

Ek olarak, bir numunedeki proteinler matris ile etkileşime girebilir. Zayıf etkileşimler proteinlerin hızlı bir şekilde geçmesine izin verirken, güçlü etkileşimler proteinleri sütun içinde tutar.

Çözücünün pH veya iyonik kuvvetindeki kademeli bir değişiklik, proteinlerin matris ile etkileşimlerini değiştirir ve proteinlerin ayrı fraksiyonlara ayrılmasına yardımcı olur.