32.10: İmmünopresipitasyon

İmmünopresipitasyon veya IP, protein-protein etkileşimlerini, kuaterner yapıları veya supramoleküler kompleksleri incelemek için proteinleri veya protein komplekslerini doğal hallerinde izole etmek için protein-antikor etkileşimlerini kullanan yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Kromatin IP, çapraz bağlama IP’si ve floresan IP’si dahil olmak üzere tekniğin çeşitli modifikasyonları yaygın olarak kullanılmaktadır.

Kromatin İmmünopresipitasyonu

ChIP olarak da bilinen kromatin immünopresipitasyonu, protein-DNA veya protein-RNA etkileşimlerini incelemek için kullanılır. Gen transkripsiyonu, DNA replikasyonu, rekombinasyon ve onarım, hücre döngüsü ilerlemesi ve epigenetik gibi önemli hücresel süreçleri incelemek için önemli bir tekniktir. Çeşitli transkripsiyon faktörlerinin, histonların ve diğer düzenleyici proteinlerin bağlanma bölgelerinin in vivo konumunun tanımlanması da yararlıdır.

ChIP’deki ana adımlar arasında fiksasyon, sonikasyon, immünopresipitasyon ve analiz bulunur. Formaldehit gibi bir sabitleme maddesi kullanılarak hedef proteinin DNA ile çapraz bağlanmasını ve ardından daha küçük kromatin fragmanları elde etmek için sonikasyon veya enzimatik hidrolizi içerir. Teknik daha sonra, bir immünopresipitasyon reaksiyonunda proteine bağlı DNA’yı yakalamak için ilgilenilen proteine karşı spesifik yüksek afiniteli antikorlar kullanır. Çapraz bağlama daha sonra DNA’yı ilişkili proteinlerden serbest bırakmak için yüksek ısı, yüksek tuz konsantrasyonu ve proteinaz K kullanılarak tersine çevrilir. DNA, analize hazırlamak için daha da saflaştırılır.

Çapraz bağlama İmmünopresipitasyon

Çapraz bağlama immünopresipitasyonu veya CLIP, endojen RNA üzerindeki protein bağlanma bölgelerinin bölgelerini, aktif transkripsiyon fazında birlikte çökelterek tanımlar. RNA molekülleri, onları sıkıca bir arada tutmak ve bozulmalarını önlemek için proteinlere çapraz bağlanır. Komplekslerin parçalanması ve izolasyonu için prosedür ChIP’ye benzer. Bu teknik, RNA’nın RNA bağlayıcı proteinlerle etkileşimini ve bunların çeşitli biyolojik sistemlerdeki modifikasyonlarını incelemek için kullanılır.

IP’nin Sınırlamaları

İmmünopresipitasyon teknikleri, saflaştırma adımlarının sayısını azaltma eğiliminde olsa da, bazı sınırlamaları vardır. Antikor bağlayıcı rekombinant bakteriyel proteinler, agaroz boncuklarına konjuge protein A veya G proteinleri ve yöntemde kullanılan antikorlar, saflaştırılmış protein preparatına kontaminantlar ekleyerek spesifik olmayan bağlanmaya uğrayabilir. Ayrıca, boncuklar üzerindeki antikorların immobilizasyonu optimizasyon gerektirir ve zaman alıcıdır. Antijen-antikor kompleksinden sonra boncukların yıkanması kritiktir, ancak bu aşamada hedef proteini kaybetme olasılığı vardır.