32.11: Etiketleme ve Füzyon Proteinleri

Proteinler çeşitli hücresel süreçlerde ve biyokimyasal reaksiyonlarda yer alır. İlgilenilen belirli bir proteini analiz etmek, hücredeki diğer proteinlerden izole edilmesini gerektirir. Bu, büyük miktarlarda hedef protein üretmek için spesifik genin uygun bir konakta aşırı eksprese edilmesiyle elde edilir. Bir etiket veya etiket, hedef proteini ve etiketi içeren bir füzyon proteini üretmek için gen ile yeniden birleştirilir. Bu füzyon proteinleri üzerindeki etiketler daha sonra kolay tespit ve saflaştırma işlemleri için kullanılabilir. Afinite etiketleri, epitop etiketleri, muhabir etiketleri, floresan etiketler ve kendiliğinden birleşen intein etiketleri, mevcut çeşitli protein etiketlerinden sadece birkaçıdır.

Glutatyon S-transferaz Etiketi

Glutatyon S-transferaz (GST), rekombinant proteinleri etiketlemek için yaygın olarak kullanılan bir 211 amino asit proteinidir. İlgilenilen geni ve GST için DNA dizisini içeren bir ekspresyon vektörü, E.coli gibi uygun bir konakta ekspresyon için kullanılır. Rekombinant protein, N-terminalinde veya C-terminalinde GST ile etiketlenebilir. GST etiketi, etiketlenmemiş doğal proteine kıyasla füzyon proteininin çözünürlüğünü de arttırır. GST bir enzim olduğundan, substratı olan glutatyona yüksek bağlanma özgüllüğüne sahiptir. Bu substrat özgüllüğü, GST etiketli proteinleri, glutatyon kaplı boncuklardan oluşan bir matris kullanılarak afinite kromatografisi ile saflaştırmak için kullanılır.

Etiket: Bölünme ve Kendinden Birleştirme

Protein etiketleri, hedef proteinin saflaştırılmasına izin verirken, daha fazla protein analizini engelleyebilir. Bu gibi durumlarda, etiketler proteolitik enzimler kullanılarak parçalanır. Bu proteazlar yalnızca belirli bölgelerde parçalandığından, füzyon proteinleri, hedef protein ile etiket arasında bu tür bölünme bölgeleri ile tasarlanmıştır. Başka bir yöntem, ek enzimler olmadan hedef proteinden etiketleri birleştiren inteinler adı verilen kendi kendini birleştiren protein segmentlerini kullanır. Bu yöntemde, bir intein segmenti, etiket ile hedef protein arasına yerleştirilen füzyon proteinine de yeniden birleştirilir. Bu inteinler, yalnızca tiyol bileşiklerinin varlığı veya belirli pH ve sıcaklık gibi belirli koşullar altında kendi kendine birleşir. Bu nedenle, daha fazla analiz için saf hedef proteini elde etmek için füzyon proteininin saflaştırılmasından sonra eklemeleme spesifik olarak indüklenebilir.