32.14: İki boyutlu Jel Elektroforezi

İki boyutlu jel elektroforezi, ilk olarak 1975'te O' Farrell ve Klose tarafından tanıtılan yüksek çözünürlüklü bir protein ayırma yöntemidir. Bu yöntem, proteinin kütle ve yük olmak üzere iki boyuta göre ayrılmasını içerir ve bu da onu tek boyutlu jel elektroforezinden daha doğru kılar.

Birinci boyut ayrımı, proteinleri izoelektrik noktalarına göre ayıran hareketsizleştirilmiş pH gradyanı (IPG) şeritleri üzerinde gerçekleştirilen izoelektrik odaklama veya IEF tekniğini kullanır.

Hücreler ve dokular gibi biyolojik numuneler ilk olarak üre, ditiyotreitol, deterjanlar ve amfolitler içeren bir tamponla işlenerek IEF için hazırlanır. Burada üre ve deterjan proteinleri çözündürür ve denatüre eder. Ditiyotreitol, disülfit bağlarını parçalayan bir indirgeyici maddedir. Uygun konsantrasyonda kullanılan amfolitler proteini çözündürür ve pH'ı korur. Tampon ayrıca IPG şeridini yeniden nemlendirerek proteinlerin yük bazlı ayrılmalarından önce emilmesine yardımcı olur.

Proteinler pozitif ve negatif yüklere sahip amfoterik moleküllerdir. Amfoterik protein molekülleri, elektrik akımı altında IPG şeridinin pH gradyanı üzerinde hareket eder. Proteinler izoelektrik noktalarına ulaştıklarında hareketsiz hale gelirler çünkü bu noktada net yükleri yoktur. IPG şeritleri sabit bir pH gradyanına sahiptir; örneğin, daha küçük pH aralığına (örneğin, pH 4-7) sahip şeritler, proteinleri daha geniş aralığa (pH 3-10) sahip şeritlerden daha yüksek doğrulukla tespit edebilir. Proteinler ayrıldıktan sonra IPG şeritleri, bir sonraki aşamaya, yani SDS-PAGE (poliakrilamid jel elektroforezi) kullanılarak kütle bazlı ayırmaya geçmek için sodyum dodesil sülfat (SDS) tamponu ile işlenir. SDS, IPG şeritleri üzerindeki yüksüz proteini negatif yük ile kaplar ve gliserol, proteinlerin birinci boyuttan ikinci boyuta transferine yardımcı olan elektroendozmozu azaltır.

Genellikle jel üzerindeki bantlar boyama sonrasında görülebilir. Bazen otoradyografik bir görüntü elde etmek için radyo etiketli numuneler kullanılır. Floresan görüntüler üretebilen numuneler de kullanılabilir.

Sonuç sonuçlarının kesinliği nedeniyle iki boyutlu jel elektroforezi önem kazanmıştır. Ancak yöntem, yüksek derecede hidrofobik proteinleri, yüksek moleküler kütleye sahip proteinleri veya hücre başına çok düşük miktarlarda bulunan proteinleri ayırt etmek için uygun değildir.

İki boyutlu jel elektroforezi, protein ayrımı için iki boyutu birleştirir: birincisi yüke dayalı ve ikincisi kütlece.

İlk boyut, izoelektrik odaklama veya IEF yöntemini kullanır. Burada, protein numunesi hareketsizleştirilmiş bir pH gradyanı veya IPG şeridi üzerine yüklenir.

Elektrik akımı uygulandığında, proteinler şerit üzerindeki pH gradyanı boyunca hareket eder ve izoelektrik noktalarında - proteinlerin net yük taşımadığı pH - hareketsiz hale gelir.

Daha sonra, IPG şeridi SDS ile muamele edilir ve SDS-PAGE kullanılarak ikinci boyuta göre ayrılmak üzere bir poliakrilamid jel üzerine yüklenir.

IEF'ye dik bir yönde, proteinler kütleye bağlı olarak elektroforetik olarak ayrılır.

Ayrılan proteinler daha sonra boyama sonrası görselleştirilir.

İki boyutlu jel elektroforezi, tek bir yüklü amino asit kalıntısı ile bile farklılık gösteren benzer proteinleri tanımlayabilen yüksek çözünürlüklü bir tekniktir.

Ayrıca, farklı koşullar ve gelişim aşamaları sırasında bir hücre veya organel içindeki protein modifikasyonlarını tespit edebilir.