33.4: İmmünofloresan Mikroskobu

Bir floresan mikroskobu, bir ışık kaynağından enerjiyi emebilen ve daha sonra bu enerjiyi görünür ışık olarak yayabilen florokromlar adı verilen floresan kromoforları kullanır. Florokromlar, kontrast oluşturmak için numuneye eklenen doğal olarak floresan maddeleri (klorofiller gibi) ve floresan lekeleri içerir. Texas kırmızısı ve FITC gibi boyalar florokromlara örnektir. Diğer örnekler arasında nükleik asit boyaları 4 ‘, 6’-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ve akridin portakalı bulunur.

Mikroskop, numuneyi ultraviyole veya mavi ışık gibi kısa dalga boylu uyarma ile ışınlar. Kromoforlar uyarma ışığını emer ve daha uzun dalga boylarında görünür ışık yayar. Uyarma ışığı daha sonra filtrelenir (kısmen ultraviyole ışık gözler için zararlı olduğu için), böylece oküler mercekten yalnızca görünür ışık geçer ve numunenin koyu bir arka plana karşı parlak renklerde bir görüntüsü üretilir.

Floresan mikroskoplar patojenleri tanımlayabilir, bir ortamdaki belirli türleri bulabilir veya bir hücre içindeki belirli moleküllerin ve yapıların yerlerini bulabilir. Belirli florokromları alıp almadıklarına bağlı olarak canlı hücreleri ölü hücrelerden ayırt etmek için yaklaşımlar da geliştirilmiştir. Bazen, farklı yapıları veya özellikleri göstermek için aynı numune üzerinde birden fazla florokrom kullanılır.

Floresan mikroskobunun en önemli uygulamalarından biri, antikorların onlara bağlanıp bağlanmadığını gözlemleyerek belirli mikropları tanımlamak için kullanılan immünofloresandır. (Antikorlar, bağışıklık sisteminin ürettiği ve onları öldürmek veya inhibe etmek için belirli patojenlere bağlanan protein molekülleridir.) Bu tekniğin iki yaklaşımı vardır: doğrudan immünofloresan testi (DFA) ve dolaylı immünofloresan testi (IFA). DFA’da, spesifik antikorlar (örneğin, kuduz virüsünü hedef alanlar) bir florokrom ile boyanır. Örnek hedeflenen patojeni içeriyorsa, floresan mikroskobu altında patojene bağlanan antikorlar gözlemlenebilir. Bu bir birincil antikor boyasıdır, çünkü lekeli antikorlar doğrudan patojene bağlanır.

IFA’da ikincil antikorlar, birincil antikorlar yerine bir florokrom ile boyanır. İkincil antikorlar doğrudan organizmaya bağlanmazlar, ancak birincil antikorlara bağlanırlar. Boyanmamış primer antikorlar patojene bağlandığında, floresan sekonder antikorların primer antikorlara bağlandığı gözlemlenebilir. Böylece, ikincil antikorlar dolaylı olarak patojene bağlanır. Birden fazla ikincil antikor sıklıkla bir birincil antikora bağlanabildiğinden, IFA numuneye bağlı floresan antikorların sayısını artırarak özelliklerini görselleştirmeyi kolaylaştırır.