32.9: Kolon Kromatografisi Türleri

Kolon malzemesinin numunelerle stabilitesi ve uyumluluğu, kromatografik tekniklerde etkili saflaştırma için çok önemlidir. PH, sıcaklık veya solvent gibi çeşitli çalışma parametreleri, kolon malzemesinin paketlenmesini etkiler, dolayısıyla saflaştırma verimliliğini belirler. Kolon malzemesinin seçimi aynı zamanda çalışma parametrelerinin belirlenmesinde de önemli bir rol oynar ve saflaştırılması gereken proteinlere göre değiştirilebilir.

Jel Filtrasyon Kromatografisi

Proteinin kimyasal yapısı bilinmediğinde boyuta dayalı saflaştırma için jel filtrasyon kromatografisi kullanılır. Düşük basınçlı sistemler için agaroz, poliakrilamid, dekstran türevleri veya silika boncukları gibi matriksler kullanılırken, daha yüksek akış hızları için polimerik reçineler kullanılır. Bu polimerik malzemelerin değişen çapraz bağlanma derecesi, ayrılabilecek proteinlerin boyut aralığını belirleyen matriksin gözenek boyutunu belirler.

İyon Değiştirme Kromatografisi

İyon değiştirme kromatografisi, proteinleri izoelektrik noktaları veya pl'si ile belirlenen belirli bir pH'taki net yüklerine göre saflaştırabilir. Matriks reçinesindeki net yük, matriks reçinesindeki katyonları veya anyonları yüklü proteinlerle değiştirerek zıt yüklü proteinleri saflaştırmak için kullanılır. Reçineler, değiştirilen iyon türüne göre kategorize edilir; pozitif yüklü proteinler, katyon değişim reçinelerindeki katyonların yerini alır ve bunun tersi de geçerlidir. Geniş bir tampon pH aralığında stabiliteye sahip güçlü iyon değiştiriciler arasında kuaterner amonyum, sülfonat ve sülfopropil reçineler bulunur. Bunun aksine, yalnızca dar bir pH aralığında etkili olan zayıf iyon değiştiriciler arasında dietil aminoetil (DEAE) veya karboksimetil (CM) reçineleri bulunur.

Afinite kromatografisi

Afinite kromatografisi, proteine özgü antikorların veya enzime özgü substratların, genellikle agaroz boncuklar olmak üzere kolon malzemesine immobilize edilmesini içerir. Örneğin, spesifik antijenleri ayırmak için seçilen hareketsizleştirilmiş antikoru içeren bir sütun hazırlanır. Karışık antijen örneği kolondan geçirildiğinde hedef antijenler hareketsizleştirilmiş antikorlara bağlanır ve karışımdan ayrılır. Beta-galaktosidaz gibi enzimlerle etiketlenmiş rekombinant proteinleri ayırmak için, ilgili substrat İzopropil-β-D-tiyogalaktopiranosid (IPTG), enzimi saflaştırmak üzere kolon üzerinde hareketsiz hale getirilir.

Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ve gaz kromatografisi (GC), en yaygın kullanılan kolon kromatografi teknikleridir. HPLC'de solvent, verimliliği artıran, sıkı bir şekilde paketlenmiş bir kolondan yüksek basınçta akar. Gaz kromatografisi, uçucu bileşikleri ısıtma sonrasında gaz formlarına dönüştürerek analiz eder. Uçucu hale gelen numune, nitrojen ve helyum gibi inert gazlar tarafından kolonun içinden itilir.

Jel filtrasyonu, iyon değişimi ve afinite kromatografisi, bir protein süspansiyonu gibi bir karışımdan saf bileşikleri çıkarmak için kullanılan yaygın kolon kromatografisi türleridir.

Jel filtrasyon kromatografisi, belirli gözenek boyutları oluşturmak için inert bir polimerik jel boncuk matrisi kullanır.

Bir protein süspansiyonu durumunda, gözenek boyutundan daha büyük proteinler önce elüte olurken, daha küçük olanlar jel boncuklarda hapsolur. Bu sıkışmış proteinler daha sonra çoklu çözücü yıkamaları ile ayrıştırılabilir.

Buna karşılık, bir iyon değişim kolonu, belirli bir pH'ta net bir pozitif veya negatif yük veren zayıf asitler veya bazlarla kaplanmış matris boncuklarla doludur.

Bu, zıt yüklü proteinlerle iyonik bağlar oluşturarak proteinleri yüzey yüklerine göre ayırmaya yardımcı olur.

Son olarak, afinite kromatografisi, spesifik bağlanma etkileşimlerine dayalı bir karışımdan bir hedef proteini çıkarmak için antikorlar gibi ligandlarla etiketlenmiş bir matris kullanır.

Afinite ve iyon değişim kromatografisinde, hedef protein son olarak, pH, iyonik kuvvet veya rekabetçi bir molekülün eklenmesi gibi koşullardaki bir değişiklik nedeniyle kolon-protein etkileşimlerini zayıflatan bir elüsyon çözücüsü eklenerek ayrıştırılır.