Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm I: Sindirim ve Pankreas Doku Koleksiyon

19.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/1125

⸱

26 Mayıs 2009

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Illinois, Chicago

Bu makalede

Özet

, Yüksek kalite ve insan adacıklar uygun miktarda sağlamak başarılı bir adacık nakli için önemli önkoşullar biridir. Bu video, adım adım tarif insan pankreas adacık izolasyonu için prosedürler: değiştirilmiş bir otomatik yöntemi kullanılarak (bölüm I sindirim ve pankreas dokusu toplanması).

Özet

Tip 1 diyabet Yönetimi, yıl içinde 100 milyar dolar maliyet, hem birey ve toplum, külfetli. Glikoz izleme ve yeni insülin formülasyonları yaygın kullanımına rağmen birçok kişi hala yıkıcı ikincil komplikasyonlar gelişir. Pankreas adacık nakli, diyabetik hastalarda normal glukoz kontrolü yakın geri yükleyebilirsiniz

Protokol

1. Tesis kurulum

  1. İnsan adacık izolasyonu, takım çalışması gerektirir bir zaman hassas bir işlemdir ve bu nedenle, dört kişi bu işlemi yapmak için ihtiyaç vardır. Takım masaya ve pankreas cannulates cerrah tarafından yönetilmektedir.
  2. Adacık izolasyon ekibi UIC adacık izolasyonu tesisi girer dakika başlar. Ekip üyeleri, santrifüj gibi, gerekli tüm enstrümantasyon, kontrol edilir ve açık olduğunu emin olun. Ayrıca, tüm davlumbaz ve yüzeyleri sterilize etmek için emin olun.
  3. İki kişi kanülasyon tablo, sulu kar makinesi, sindirim devre, perfüzyon ünitesi, COBE arıtma makine ve cerrahi masaları kuracak.
  4. Aynı zamanda, diğer iki ekip üyeleri, izolasyon sırasında gerekli ortam hazırlayacaktır.
  5. Sonra, bakteriyoloji tüpleri (şişe, tüp, form ve çanta), numune alma tüpleri (ön yıkama ile dolu) ve değerlendirme tüpleri ve plakaları hazırlanır.
  6. Aşağıdaki gibi ayarlayın arıtma tüpü hazırlayın: 1. tüp boş ve 150 ml işaretli, tüpler 2-12, 200 ml insan albumini (yıkama solüsyonu) ile desteklenmiş M199 medya ile doldurulmuş ve 230 ml 'işaretli, ve nihayet 50 ml konik tüp 50 ml yıkama solüsyonu ile doldurulur. Bu hazırlık adımları biz hazırlanması ve pankreas perfüze başlamaya hazır tam.

2. Pankreas hazırlanması ve perfüzyon

  1. Hazırlanması ve pankreasın perfüzyon başlamak için, bir operatör, steril tekniği kullanarak ambalaj organ kaldırır. Cerrah dekontaminasyon tablo pankreas transfer olacak.
  2. Cerrah orijinal pankreas koruma çözümü ve hazırlanan "İhale" bakteriyoloji şişeleri doldurmak için kullanan bir operatörü, el ile bir adet 60 ml şırınga dolduracaktır.
  3. Organ adacık izolasyonu (pankreas, satın alma sırasında hasar veya anatomik olarak anormal ise, adacık izolasyonu için kullanılan) için uygun olup olmadığını belirlemek için bir görsel denetim sonra, cerrah kollajenaz hazırlamak için bir operatör soracaktır. Yeniden askıya alınması zaman farklı enzim marka ve birçok arasında değişmektedir unutmayın.
  4. Cerrah hazır olduğunda, dekontaminasyon tablo (Betadine, Fungizone / Sefazolin ve HBSS) dekontaminasyon çözümler getirmek ve onlara uygun kaplar içine dökün. Cerrah, bir dakika için her dekontaminasyon çözüm pankreas pankreas yıkama dekontaminasyon gerçekleştirir. Pankreas sonra tartılır olacağı küçük steril bir kavanoza konur. Ağırlığı toplu kayıt içine girildikten sonra, pankreas, bazı koruma çözümü ile kanülasyon tavaya konur.
  5. Cerrah ortaya çıkarmak ve kısmen ana kanalı insizyon ve bir kanül ile pankreas her bir yarısı cannulate. Kanül dikiş tarafından temin edilecektir. Pankreas serpmek için, ilk perfüzyon ünitesi taşımak ve enzim çözeltisi havza içine dökün. Toplam perfüzyon süresi 5 dakika için 180 mmHg, sonra 5 dakika süreyle 80 mmHg, yaklaşık 10 dakika. Pankreas perfüzyon sonra şişmiş.
  6. Kanülasyon tavaya yağ dokusu, pankreas dikkatli bir şekilde kesilmiş perfüze pankreas, taşıyın. Sonra 10-12 parçalar halinde kesilmiş ve pankreas sindirim için Ricordi Odası transfer.

3. Pankreas sindirim

  1. Sindirim adım başlamak için, boş Ricordi Odası pankreas aktarmak, ekranda koymak Pulmozyme 2.5 ml şişe, (odası doku blok büyük bir yığın önlemek) eklemek, oda kapatın ve sistemi doldurun.
  2. 5 dakika boyunca çözüm pompalama başlayın. Odanın sıcak bir çözüm boyunca eşit dağıtmak için hafifçe sallayın. Beş dakika sonra, tüm sindirim aşaması için odasına yavaşça sallayın. 37 ° ˚ C sıcaklık koruyun
  3. Rock odasının sıcaklığı 37 °, sonra odasına sallamak ulaşıncaya kadar yavaşça. Bir numune alın ve her iki dakikada bir ücretsiz adacıklar kapsamında olup olmadığını algılayabilir. Toplu kayıt sindirim tabloda adacık değerlendirme bilgileri kaydedin. Adacık yüzdesi% 50 çözüm ücretsiz ve izole edilmiş yüzen kadar izlemeye devam edin.

4. Doku toplama

  1. Adacıklar% 50 örneklerinde bulunur, sindirim devresinde soğuk RPMI seyreltme çözüm ekleyerek durdurulur. Doku, 500 ml konik tüpler 30 ml İnsan Albumin ile önceden doldurulmuş toplanan. Tüpler emme süpernatantı kapalı döndü ve pelet soğuk yıkama solüsyonu ile yıkayın. 1 dakika, 4 ˚ C 1100 RPM (dakikadaki dönüş) konik tüpler Spin
  2. Tek bir 500 ml konik içine sindirilmiş pankreas dokusu ile askıya alma tüpleri birleştirin. Bir tüp, yıkanmış doku dolu olduğunda, spin ve tüm doku birden çok kez yıkanmış kadar yıkama işlemi tekrarlayın. Bu tüp spin ve tek bir 250 ml konik tüp içine doku transferi. 250 ml ile ses getirM199 yıkama solüsyonu HA ile desteklenmiş ve örnekleme için hazırlamak.
  3. Bir pipet yardımıyla 1 ml örnek alın ve önceden 9 ml yıkama solüsyonu ile dolu bir 15 ml konik tüp ekleyin. Daha sonra bir ızgara sayma çanak içine doğrudan 1ml dışarı yavaşça tersine 15 ml konik tüp ve bu örnek karıştırın. Hücre sayımı ve seyreltme faktörü 2500 (10x250) kullanarak hücre sayısını hesaplamak.
  4. 250 ml konik tüp Spin ve UW (Wisconsin Üniversitesi) genellikle organ korunması için kullanmak Çözüm 150 ml. UW eklendiğinde, pipet kullanarak hücre süspansiyonu iyice karıştırın. UW başlangıç ​​zamanını kaydedin ve arıtma operatörü iletişim. Buz ve bazen girdap tüp (ler) bırakın. Şimdi adacıklar arındırılmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Izolasyon sonucu 9,10 etkileyen çeşitli faktörler vardır. Bunların arasında, pankreas dokusu sindirim önemli bir rol oynar. Kendi insan adacık izolasyon deneyimine dayanarak, potansiyel adacık verim ve kaliteyi etkileyebilecek kritik noktaları, aşağıda özetlenmiştir.

  1. Enzimlerin farklı türleri kullanılmaktadır sindirim süresi farklı.
  2. En kısa sürede% 40-50 olarak asiner doku tamamen ayrılmış adacıklar, sindirim seyreltme çözüm ekleyerek ve doku soğuma derhal durdurulması olmalıdır.
  3. Doku Na...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Teşekkürler

University of Illinois at Chicago gibi Adacık Hücre Kaynak Merkezi NIH hibe (RFA-RR 05-003), Christopher Vakfı, Efroymson Vakfı ve Tellabs Vakfı fon tarafından desteklenir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Buz Karı MakinesiekipmanTaylor CompanyK4036546steril buz hazırlamak
SantrifüjekipmanBeckman Coulter Inc.424803
MZ6 Evirt Inverted Mikroskopi TLBD4.1ekipmanLeica Microsystems4103
2 mm Izgaralı Hücre Kültür KabıekipmanNalge Nunc international174926adacık sayımı
Dijital Benmari EX7ekipmanNesLab105361058
TermometreekipmanIBI:IR60444
MonoBloc Terazi AB 104-SekipmanMettler Toledo1119430864pankreas ağırlığını ölçmek
MasterFlex II Hız Kontrol CihazıekipmanCole-ParmerJ00006445digesyon sırasında akış hızını ayarlamak
Dijital Sight DS L1ekipmanNikon Instruments217267
Perfüzyon ÜnitesiekipmanÖzel Yapımn/a
Perfüzyon ünitesi için soğutucuekipmanFisher Scientific3013P
Ricordi OdacığıekipmanUniversity of Miamin/a
RPMI dilüsyon solüsyonureaktifMediatech, Inc.99783024
Wisconsin Üniversitesi (UW) solüsyonureaktifDURAMED1000-46-06
Hank’s Dengeli Tuz Solüsyonu (HBSS)reaktifMediatech, Inc.99-597-CM
%25 İnsan AlbuminireaktifGRIFOLSNDC 61953-0002-2
M199 medyumu (yıkama solüsyonu)reaktifMediatech, Inc.99-784-CM
Kollagenaz NB1 GMP kalitereaktifSERVA ElectrophoresisN0002937
Nötr Proteaz NB1 GMP kalitereaktifSERVA ElectrophoresisN0002936
BetadinereaktifCardinal Health29906-004
SefazolinreaktifWest-Ward PharmaceuticalNDC 0143-9924-90
DitizonreaktifSigma-AldrichD5130

Kaynaklar

  1. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
  2. Nano, R., et al. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
  3. Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
  4. Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
  5. Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
  6. Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
  7. Salehi, P., et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
  8. Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).
  9. Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85, 950-955 (2008).
  10. Toso, C., et al. Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Doku SindirimiEnzim Perf zyonuKollajenaz Sol syonuRicordi Sindirim OdasSo uk RPMI Dil syonuDoku Y kamaH cre Say mUW Sol syonuSafla t rma Haz rl
İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm I: Sindirim ve Pankreas Doku Koleksiyon
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.