$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bölüm 1: döküm kalıpları inşa birleştirin.
- Yarıya silikon tüp (VWR) ve 3 cm uzunluğunda parçalar halinde kesmek için jilet kullanın.
- Hortumun her iki ucundaki iç implant dereceli RTV silikon yapıştırıcı (Rhodia) bir damla yerleştirin.
- Silikon yapıştırıcı açılan küçük bir parça polyester örgü (1 cm x 1 cm) (McMaster-Carr) hızlı bir şekilde yerleştirin ve hortumun ucu ile aynı hizaya getirin. Bu yapı eki için biraz yükseltilmiş ve düz bir yüzey sağlayacaktır. Diğer ucu için tekrarlayın.
- Kalıp, 3 gün boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın. Bu aslında tek olarak, bir defada 20 ila 30 kalıp yapmak için yararlı olur.
- Yapıştırıcı tamamen kuruduktan sonra ihtiyaç duydukları kadar,% 70 etanol ile dolu bir beher bu kalıpları saklamak. Bu adım kalıpları sterilize yardımcı olacak ve bitmiş ürün Şekil 1'de gösterilmiştir.
Bölüm 2: myoblast hücre izolasyonu için Hazırlık
- 250 1 mg Laminin (Sigma) sulandırınız ml 0.22 mikron filtre ile sterilize edilmiş fosfat tamponlu salin (PBS) ve% 1 penisilin / Streptomisin (Invitrogen) ve% 1 Fungizone (Invitrogen) içeren.
- Coat 150 mm 4 seyreltilmiş Laminin çözüm adımı 1.1 mL ve birincil iskelet matür kaplama önce en az 4 saat süreyle 37 º C'de inkübe doku kültürü levhalar (BD Falcon).
- (% 20 FBS (Atlanta Biyolojik), 5 ng / L temel Fibroblast Büyüme Faktörü (Promega), 1% Penisilin / Streptomisin (Invitrogen), ve% 1 Fungizone Ham F-10 Besin Karışım (Sigma) karıştırma myoblast orta olun Invitrogen).
- 1 g, 100 mL 2.4 U / ml Dispase-2 (Roche) ~ 295 U / mg kollajenaz 2 (Worthington) eriterek iskelet kas sindirim çözüm hazırlayın. 0.037 g CaCl 2 ekleyin ve iyice karıştırın. -20 ° C'de 10 ml şırınga ve mağaza alikotları takılan bir 0,2 mikron filtre disk kullanarak sindirim tampon sterilize filtreleme 37 ° C myoblast medya ile birlikte doku sindirim için gerekli olan miktar koyun.
Bölüm 3: iskelet kas Myoblast izolasyonu
- Forseps ve küçük bir makas kullanarak, omurilik boyunca arka dilimleme cilt ve fasya tabakaları geri soyma ve sonra kasların eksize ölü yenidoğan Lewis sıçan paraspinal kaslar çıkarın.
- Bir doku kültürü kaputu, buz üzerinde 1X Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi 40 ml (HBSS) (Invitrogen) ile dolu bir 50 ml konik tüp (BD Falcon) eksize kasları yerleştirin. Kas şeritleri tüp altına yerleşmek ve dikkatli bir kültür kapağı (Baker), steril bir Pasteur pipet yardımıyla vakum emme sıvı ve kan kalıntılarının en çıkarmak için izin verin.
- Hasat kas adet 150 mm kültür çanak üzerine dökün ve mümkün olduğunca emme ile kalan sıvı kadar kaldırın. 2 tek kenarlı Jilet kullanmak kalın bir macun doku kıyma. Hamurun üzerine dökün ve önceden ısıtılmış sindirim çözüm karışımı 10 ml pipet kullanarak yeni bir 50 ml tüp transferi. Enzimatik sindirim sırasında, doku bazen telsiz Pipet-Aid (Drummond) takılan 10 ml pipetle (köpüren olmadan) triturated konumundadır. Yine, aşırı sıvı doku yerleşmek ve kaldırmak için izin verir.
- Sallanan bir platform üzerinde tüp yerleştirin ve yaklaşık 30 dakika süreyle 37 º C'de sindirimi.
- Kas sıvılaştırılmış sonra, 600 xg (Beckman GP) 10 dakika boyunca oda sıcaklığında 70 mikron hücre süzgecinden (BD Falcon) ve santrifüj yoluyla çözüm geçmek. Pasteur, pipet ve emme ile sıvı kadar mümkün olduğunca kaldırın ve tekrar süspansiyon, 10 ml sıcak myoblast orta pelet.
- Ön plakası 15 dakika boyunca bir kaplanmamış 150 mm doku kültürü plaka hücreleri fibroblastlar kaldırmanıza yardımcı olmak için.
- Henüz laminin kaplı Kültür varlıkları bağlı ve her 1 ila 2 sıçan yavrular için bir tabak olacak şekilde seyreltik hücreleri aktarın. 37 ° C ile% 5 CO 2 nemlendirilmiş bir inkübatör seti plaka koyun.
Bölüm 4: Döküm mühendislik doku yapıları (5 ml)
- 1 ila 2 gün sonra, 10 inkübatör 150 mm myoblast doku kültürü tabak kaldırmak için, 37 ° C 1X PBS ile iki kez yıkayın ve sıcak,% 0.05 tripsin-EDTA 4 mL her plaka ekleyin. 5 dakika süreyle inkübatör plakaları geri dön.
- Kültür kaputun içindeki plakalar müstakil matür Hasat ve 50 ml tüp içinde sıvı (BD Falcon) toplayabilir. 10 ml myoblast orta plakaların yıkayın ve santrifüj tüpüne hücreleri birleştirmek için kullanın. Pelet 600 xg (Beckman GP) 10 dakika oda sıcaklığında hücreleri ve adım 3.5 'te açıklandığı gibi aşırı sıvı kaldırmak.
- Buz üzerinde myoblast orta ve yerin 1.6 mL myoblast hücreleri tekrar
- Forseps kullanarak dikkatli bir şekilde adım 1,5 'dan 4 yapı kalıpları kaldırmak ve onları 1X PBS ile iki kez yıkayın. 6-iyi bir doku cu her kalıp yerleştirmeden önce Pasteur pipeti ile PBS tüm izlerini kapalı vakum emmelture plaka (BD Falcon).
- Buz üzerinde yapı hazırlanması için gerekli diğer reaktifler (10X Ham F10, antibiyotikler, tip 1 kollajen [3,9 mg / ml] [6] ve Matrigel ™) toplayın ve 37 º C'de myoblast medya tutmak 500 mcL 10X Ham F10, 100 mcL Penisilin / Streptomisin, 100 mcL Fungizone, 1.6 ml kollajen, ve 15 ml konik tüp içinde 750 mcL Matrigel ™ birleştirdik. 10 sn buz üzerinde 10 Mini-Vortexer (VWR) ve yeri için çözüm karıştırın.
- Sonra, adım 3.5 80 NaHCO 3 mcL ve 3.3 adım myoblast süspansiyon karışıma ekleyin. 10 sn vorteksleyin tüm karışım ve baloncuklar çözüm temizlemek için birkaç dakika süreyle buz kovası tüp.
- 10 ml pipet kullanarak katılaşmaya başlamadan önce kalıplar içine karışımı dikkatlice döküm. Her kalıp viskoz sıvı yaklaşık 1 ml yapacak. Bu işlem sırasında hava kabarcıkları tanıtan önlemek için deneyin.
- Inkübatör dökme yapıları içeren plaka dikkatlice aktarın. ~ 30 dakika sonra, inkübatör katılaşmış yapıları kaldırmak ve doku inşa kapsayacak şekilde dikkatle, her bir kuyunun myoblast orta eklemek. Inkübatör (Şekil 2) plaka dönün.
Bölüm 5: Temsilci sonuçları
Bu protokol düzgün çalıştırıldığında, myoblast içeren doku inşa in vivo implantasyon için hazırdır (küf kaldırılır gibi) ya da 2 gün sonra in vitro analizler Daha fazla bilgi için .
Şekil 1. tamamlanan yapı kalıp örnekleri (Adım 1.5 'e bakınız).
Şekil 2 katılaşmış myoblast içeren doku [1] inşa.
Şekil 3: H & E myoblast içeren doku lekeli bölümleri oluşturun . "A" uzunlamasına bir bölümü gösteriyor ve "B" bir kesit göstermektedir.