$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bölüm 1: Doku Hazırlama
- Amacımız, sinir sisteminin sağlam olduğunu sinek larvaları bir doku hazırlama, ancak vücut duvarı kasının iç yüzeyi yapay bir hemolimf maruz kalan ve iyi optik mikroskop kapağı kayma yakın yerleştirilmiş olabilir. Diğer bir deyişle, larva hazırlık çıkış içinde.
Kesme, iğneleme ve vücut duvarı kas germe ve bazen sinir sisteminin bir parçası kaldırarak geleneksel doku preparatları içeren bu yana, biz farklı bir yaklaşım gerekiyordu.
Biz, yapısal özellikleri ve sinaps zaman içinde yapısal değişiklikler iyi bir görünüm almak istedim, çünkü iç-dış hayvanlar istedim, ve sinir sistemi sağlam tutmak istedim. Ayrıca doku germe önlemek istedim ve kasları kasılan ve görüntü berbat gerilme reseptörleri aktive.
- Yeni başlayanlar için, hayvanların sahne. Üçüncü larva Beslenme ve üçüncü larva Wandering W3 larvaları açılayacağız incelemek için büyük ve kolay. Bu hayvan Tubby fenotip ve geniş, bu yüzden tersyüz etmek kolaydır.
Biz sadece biz aktif W3 larvaları da dahil olmak üzere, tarama gördüğünü larvaları kullanılır. - Bir kurtçuk çift distile H2O bir petri çok yumuşak bir fırça ile yüzeyi temizleyin. Temizlik larvalar daha iyi optik ve temizleme bakterileri azaltır.
- HL-6, 3 ml buz hakkında küçük petri ve yapay hemolimf hayvan aktarın. Hayvan hareket durur ve (yaklaşık 5 dakika) rahatlatır kadar buz üzerinde tabak koyun.
- Bir yandan ve diğer yaylı makas çok ince uçlu forseps tutun. Benim dominant elin makas kullanın. Vücut duvarı boyunca basınç equlibrate makas ile vücut duvarında küçük bir delik açın.
- Hayvan aşağı çanak alt forseps ile yavaşça tutun ve arka iki kesimi kesmek. Organlar uzak inceleyin ve yağ vücut olasılıkla vücut boşluğunda hareket edecek. Bu doku da kesip.
- Larvaları ince forseps ile çanak alt karşı tutun. # 0 böcek pin tutun (künt bir ucu ile) ve larvaların ağız parçaları karşı itin. Eğer dışarı içinde bir çorap dönüm gibi vücut boşluğu ile ağız parçaları itin.
- Doku içinde dışarı rakam gibi görünecektir: aşağıda. Ultra-ince kesme aleti ile yağ vücut ve trachioles vücut duvarından uzak teşrih. Trachioles çekmek için gerçekten zor değil deneyin, ya da sinir sistemi çıkarın. Trachioles Kopyalamak vücut duvarı kas delik rip.
Mümkün olduğu kadar yağlı vücut çıkarın. Bu yapıların her ikisi de doku optik kalitesi bozabilir. Bu preparatın yapmadan önce kahve atlamak isteyebilirsiniz.
- Bitirdiğinizde kas şeffaf, opak veya beyaz olacaktır. Glutamat olmadan doku hazırlık HL-6 içine koyarsanız, MSS, motor desen jeneratörler çalışma olduğu için, oda sıcaklığında, büyük olasılıkla ritmik sözleşme olacaktır.
Açıkça sözleşmeli ya da düzensiz sözleşmeli vücut duvarı kas preparatlarıyla kullanmaktan kaçının.
Vücut duvarından dışarı bozulmamış içinde kolayca dorsal ve ventral midlines boyunca yarım kat eğilimindedir, bu nedenle hazırlık görselleştirmek için sol veya sağ hemi-hayvan "verir. - 1.9 Warner odası gibi küçük hacimli ticaret odasının, ya da Köprülü kapak kayma düzenleme ile bir mikroskop lamı ya doku monte edin. Montaj doku önerileri için bölüm 3 bakın.
Bölüm 2: HRP karşı floresan etiketli primer antikor ile Nöronal Bouton Etiketleme.
- HL-6 HRP karşı floresan etiketli birincil anti-beden 50 mikro litre petri bir damla koyun. Iç-dış boya banyosu içinde vücut duvarı hazırlık bırakın. Yaklaşık 5 dakika sonra nöron terminaline etiketleme, ancak tam ve parlak bir etiket için, 10-20 dakika boyunca inkübe.
- HL-6 oda sıcaklığında 10-30 saniye boya durulayın. Sigara bağlı boya durulama agresif olması gerekmez, çabuk durular.
- Boya konsantrasyonu ve inkübasyon süresi gerektiği gibi değişir.
Bölüm 3: dekstran flurophore konjuge Perisynaptic alan etiketleme
- Sulandırınız floresan konjuge dekstran boya HL-6 seyreltilir. Iyi amaçlar için çalışan bir konsantrasyon:
- Ekstrasellüler alanı içine boya erişim zamanlaması hakkında söz konusu değilse, "köprülenmiş" lamel (bkz. bölüm 4), boya, 20 mikro litre damla koyun ve boya banyosunda hazırlık yatırmak.
Bölüm 4: görselleştirme (konfokal mikroskobu ile) için doku Montajı.
(Kısa gözlemler) hazırlık serpmek gerek yok veya HL-6 küçük banyo hacmi tutmak istiyorsanız, çift köprülenmiş slayt yöntemi kullanın
Hazırlık serpmek istiyorsanız, bir perfüzyon odasında kullanmayı deneyin. Biz bir moWarner Instruments dified Odası.
Hem de takip Ayrıntılar.
Montaj bir çift köprülenmiş slayt hazırlık.
- Çok temiz bir mikroskop lamı kullanın. Superglue slayt üzerine iki kare, 18mm (1.5) lamelleri. Lamelleri kenarları 2 mm arasında bir boşluk bırakın.
- Tutkal tamamen kurumasına izin verin, ya da hazırlık etrafında sulu ortam içinde garip bir film tabakası oluşturur.
- Lamelleri kenarları arasındaki larvaları dışarı içine yerleştirin. Larvaların büyük ve görüntü toplama sistemi sınırlı bir piksel varsa diyagonal bir hazırlık konumuna gerekebilir.
- 18mm # 1.5 lamel, (çok temiz) ile doku örtün. Slayt, minimal vazelin, doku sınırdaş fişleri yapıştırılmış "top" lamel uyun.
- Üst lamel 1,3379 bir kırılma indeksi (HL-6) ile Cargill özel amacı petrol bir damla koyun ve bu derleme ters çevirin.
- Hedefi doğru mikroskop, petrol yan doku montaj pozisyonu ve objektif odak.
Değiştirilmiş bir perfüzyon odasında doku Montajı. - 20 RC odasında bir zemin oluşturmak için Tutkal 1.5 lamel. RC-20 talimatlara göre odasında doku yerleştirin. Odası için bir çatı oluşturmak yerine bir lamel Nytex mesh bir parça kullanın.
Bölüm 5: Temsilcilik Sonuçları:
- Tersyüz doku hazırlanması diseksiyonu sırası:
W3 larvaları, yıkanmış ("Tubby" fenotipi) (5.1.1). W3 larvaları, arka 2 segmentleri disseke. , Trans-vücut duvarı basıncı (ok) ile vücut boşluğu dışına itti yağ vücut görebilirsiniz. Visseral "patlaması" diseksiyonu önce vücut duvarı 1 dakika (5.1.2) küçük bir delik yaparak en aza indirmeye çalışın. Organları ile hazırlık dışarı içinde hazırlık (5.1.3) açmadan önce disseke. Pin (ok) (5.1.4) hazırlık lümen içinde çoğunlukla dışa dönük hazırlık,. Kas dışında ve manikür, (5.1.5) bağlı bazı yağlı vücut ve trachioles, iç. Neredeyse tüm yağlı vücut ve disseke trachioles (5.1.6) ile tam olarak disseke doku hazırlanması.
- Canlı larva NMJ anti-HRP kullanarak etiketleme. Glial bir uzantısı (dışarı hazırlık içinde) bir temsilci W3 larva sinir-kas sinaps. Cy5 için konjuge HRP (magenta), karşı bir anti-vücudun birincil motor nöron bouton terminalleri ile etiketlenir. Glial süreçleri GFP (yeşil) ile etiketlenir.
- Perisynaptic alan floresan hazırlık dışında bir iç Alexa 680 dekstran ile görüntülendi. Glial süreci (yeşil), membran hedef GFP ile etiketlenir. Kas yüzeyinde post-sinaptik SSR (mavi) dsRed etiketlenir. Alexa dekstran (kırmızı) formları ekstrasellüler alanlarda yoğunlaşmaktadır. Dekstran boya perisynaptic alanlarda çörek şeklinde havuzlar oluşturur. Dekstran etiketleme ve dsRed etiketli SSR gri tonlamalı gösterilmiştir. Perisynaptic alanlarda (ok) vurgulayarak çok çörek şeklinde boya havuzları unutmayın.