Vaccinia Virüs Enfeksiyonu & Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 1

Özet

Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. Part 1 3.

Protokol

Bölüm 1: enfeksiyon ayarlama

1. Matara HeLa hücreleri büyümek ve hücrelerin yaklaşık% 80 konfluent kadar bekleyin.
2. % 2 FBS ile düzenli DMEM ve ilavesiz antibiyotikler: deney için yeterli viral büyüme ortamı hazırlayın.
3. Enfeksiyon ya ham vaccinia virüs bilinen bir titreye sahip hisse senedi, ya da ev sahibi gen ekspresyonu ile ilgili endişeleriniz varsa, bilinen bir titreye sahip virüs saflaştırılmış sakaroz ile yapılabilir.
4. Doğrudan devam, sakaroz saflaştırılmış virüs kullanıyorsanız, bölüm 2.
5. Hemen önce enfeksiyonu, ham vaccinia virüs stok kullanıyorsanız, çoğunlukla buz banyosu ve bir miktar su ile bir bardak sonikatör virüsün bir kısım sonikasyon.
   • 30W yaklaşık 20 saniye boyunca sonikasyon.
   • Vorteks tüp ve buz ve soğuk dolu bardağı tutmak için gerekirse daha fazla buz ekleyerek, sonication 3 kez tekrarlayın.
   • Her sonication adım arasında vorteksleyin.
   • Bölüm 2 ile devam edin.
6. Alternatif olarak, bir fincan sonikatör sahip değilse, ham virüs stok ve 0.25mg/mL tripsin eşit miktarda karıştırın.
   • Şiddetle Vortex.
   • 37 ° C su banyosunda 30 dakika süreyle virüs stok / tripsin karışımı inkübe.
   • 5-10 dakika aralıklarla Vortex.
   • Bölüm 2 ile devam edin.

Bölüm 2: Enfekte hücrelerin

1. , Enfeksiyon istenen çokluğu (İçişleri Bakanlığı) tek tabaka bulaştırmak için gerekli viral parçacıkların miktarını hesaplayın. Tipik olarak, (5 ila 10) İçişleri Bakanlığı, yüksek enfeksiyon timecourses için kullanılır.
2. 37 sakaroz saflaştırılmış virüs veya tripsinize ham virüs istenilen miktarda ° C viral büyüme medya ve iyice karıştırın. Sadece balonun alt kapağı için yeterli medyayı kullanmak gerekir. Örneğin, medya bir T-175 şişesinde 10 ml.
3. Hücrelerden medyayı çıkartın ve oda sıcaklığında PBS ile durulayın.
4. Her balona virüs / viral büyüme ortamı ekleyin.
   • Nazikçe Swirl, 37 ° eğim plakaları ve inkübe ° C 1 saat süreyle% 5 CO2 inkübatör.
   • Tilt ve girdap levhalar her 15 dakikada düzgün virüs yaymak ve hücrelerinin nemli tutmak için.
   • Bir 0hr/Mock zaman noktası için, hiçbir virüs, sadece viral büyüme medya ekleyebilirsiniz.
5. 1 saat inkübasyondan sonra, virüsü içeren medyayı çıkartın ve oda sıcaklığında PBS ile üç kez yıkayın.
6. Her balona viral büyüme ortamının maksimum miktarda ekleyin. Örneğin, medya bir T-175 şişesinde 30 ml. 0 saat zaman noktası olarak sayma başlayın.

Bölüm 3: Hasat hücreleri

1. Hücrelerin mikroskop altında kontrol edin ve herhangi bir sitopatik etki (CPE) not edin.
2. Medyayı çıkartın ve oda sıcaklığında PBS 30 ml ile durulayın hücreleri.
3. Tripsin 15 mL hücrelere ekleyin ve 37 2-5dk inkübe ° C.
4. Hücre ayrılması için mikroskop altında kontrol edin ve hücreleri çıkarmak için şişeyi hafifçe dokunun.
5. Hücreleri, steril bir serolojik pipet yardımıyla 50 ml konik bir tüp içine aktarın.
6. Hücre büyümesi medya eşit hacmi ile şişesi yıkayın ve konik tüp tripsinize hücreleri için ortam ekleyin.
7. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g hücreleri santrifüjleyin.
8. Hücre pelet tripsin / medya çıkarın.
9. İstediğiniz RNA izolasyon kiti TRIzol reaktif veya lizis tamponu ya da hücre pelletini tekrar.
10. TRIzol kullanıyorsanız, -80 1.5mL etiketli Eppendorf tüpleri ve dondurma 1 ml alikotları örnek bölmek ° C
11. Zaman noktası başına bir şişeyi hasat, tüm zamanların noktaları için tekrarlayın.

Bölüm 4: TRIzol numune RNA ekstraksiyonu

1. Bu noktada, örnekleri işlenecek hazır TRIzol reaktif yeniden bekletildi ve olmalıdır.
2. Her bir tüp içinde TRIzol her 1 mL BCP Faz Ayırma Reaktif 200μL ekleyin. TRIzol büyük bir miktarı ile başlıyor, daha büyük bir tüp örnek aktarmak gerekebilir.
3. Vortex veya kuvvetlice çalkalanır ve oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edin.
4. 15 dakika boyunca 12.000 xg'de örnek santrifüjleyin.
5. Sulu faz temiz bir tüpe aktarın. Sulu faz açık üst katmanı. Ile başlayan TRIzol her 1 ml için yaklaşık 600μL kurtarmak olmalıdır.
6. BCP yerine ikinci bir fenol / kloroform ekstraksiyon, 1 ml TRIzol başına kloroform 500μL kullanarak bu kez yapın.
7. Vortex veya kuvvetlice çalkalanır ve oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edin.
8. 15 dakika boyunca 12.000 xg'de örnek santrifüjleyin.
9. Sulu faz temiz bir tüpe aktarın. Sulu faz açık üst katmanı.
10. Her bir örnek için doğrusal akrilamid 20μg ekleyin. Doğrusal akrilamid bir taşıyıcı gibi davranır ve RNA'yı çöktürmek için yardımcı olur.
11. Ekle 500 & micro; izopropanol L TRIzol 1 ml başına her bir örnek ile başladı ve iyice karıştırın.
12. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında numune inkübe edin.
13. 10-15 dakika maksimum hızda bir mikrosantrifüj santrifüjleyin.
14. RNA pelet tüpün alt kısmında görünür olacaktır. Çok dikkatli bir şekilde, bir vakum aspiratör ile, ya tüpten süpernatantı kaldırmak veya elle pipet. Pelet rahatsız etmeyin.
15. Pelet 1 ml% 70 etanol ile yıkayın.
    • Pelet için 1 ml% 70 etanol ekleyin.
    • En yüksek hızda 5-7 dakika boyunca 14.000 g santrifüjleyin.
    • Çok dikkatli bir şekilde, bir vakum aspiratör ile, ya etanol tüpten kaldırmak veya elle pipet. Pelet tüpün alt kısmında görünür olduğunu kontrol edin.
    • Süpernatantı atın.
16. Yıkama adımı yineleyin. Süpernatantı atılır sonra pelet tüp işaretleyin.
17. 5 dakikadan daha uzun süre Hava kuru pelet. Overdry, yoksa RNA sulandırmak için zor olacak!
18. Kalan herhangi bir DNA numune kaldırmak için isteğe bağlı DNaz tedavisini takip etmek isterseniz, nükleaz içermeyen su 17μL pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Aksi takdirde, nükleaz ücretsiz su 20μL pelet tekrar süspansiyon ve 22 adıma geçin.
19. (Opsiyonel DNaz tedavi) Qiagen RNaz-free DNaz seti kullanarak, 2μL Tampon RDD ve 1μL RNaz yeniden süspanse RNA ücretsiz DNaz sulandırılmış eklemek. Yavaşça karıştırın.
20. (Opsiyonel DNaz tedavi) 37 ° C'de 30 dakika.
21. (Opsiyonel DNaz tedavi) 2.5 mM EDTA ve inkübe 2μL 65 ° C 5 dakika DNaz inaktive. Kat daha uzun / yüksek sıcaklıklarda RNA düşmesine neden olarak inaktivasyon zaman veya sıcaklık aşmayın.
22. Spektrofotometre tarafından RNA konsantrasyonu kontrol edin.
23. -80 ° C'de RNA örnek Mağaza
24. (Opsiyonel QC) Agilent BioAnalyzer kullanarak RNA kalitesini kontrol edin, ya da örnek denatüre edici bir jel üzerinde çalışıyor ve OD okumaları kontrol. (260nm ve 260/280 oranı)

Tartışma

Kritik Adımlar

Part 1 & 2

Senkron vaccinia enfeksiyonu kurma pek çok kritik adımlar vardır, virüsün ilk olmanın dikkatli sonication (veya trypzinizing), virüs parçacıkları parçalara ayırma için. Vaccinia toplayarak için son derece eğilimli ve virüs parçacıkları bozulması hücre bile enfeksiyon sağlamak için önemlidir. Senkron bir enfeksiyon ulaşmak için (2'den fazla), İçişleri Bakanlığı, her bir hücre enfekte yüksek sağlamak için kullanılan olmalıdır. Enfekte v...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
TRIzol Reagent	Reaktif	Invitrogen	15596-026	Roche'tan TriPure gibi benzer reaktifler de kullanılabilir.
BCP Faz Ayrımı Reaktifi	Reaktif	Molecular Research Center	BP151
RNase-Free DNase Seti	Reaktif	Qiagen	79254	DNase işlemi isteğe bağlı bir adımdır.