Jonah yengeç stomatogastric sinir sistemi (STNS) ( C. poyraz Elektrofizyoloji, immünhistokimya ve hücre kültürü çalışmaları için kullanılabilir). STNS çıkarma iki bölümden yapılır: kaba ve ince diseksiyon.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kanser Borealis Stomatogastric Sinir Sistemi Diseksiyon
Bu makalede
Özet
Özet
Iyi karakterize bir hücre nispeten az sayıda (yaklaşık 25 C borealis) içerdiğinden stomatogastric ganglion (STG), hücresel ve ağ etkileşimleri çalışmak için mükemmel bir model . STG hücreler çıkışları geniş bir sergi ve mide motor eylemler için sorumludur. Mide, üç iç dişleri ile gıda ve gıda midgut ulaşmadan önce filtreler pyloru parçalayan gastrik değirmen içerir. STG merkezi desen jeneratörleri (CPG'lerin hepsi aynı) olarak bilinen mide değirmen ve pyloru kontrol etmek için iki ritmik çıkışları üretir. STG Her hücre bu ritimleri birini veya her ikisini katılabilir. Bu CPG'lerin nöromodülasyon çalışmada, homeostazı, hücresel ve ağ değişkenlik, ağ geliştirme ve ağ kurtarma için izin verir.
Jonah yengeç (Kanser borealis) stomatogastric sinir sistemi (STNS) diseksiyonu iki parça halinde yapılır; kaba ve ince diseksiyon. Brüt diseksiyon tüm mide yengeç disseke edilir. Ince diseksiyon sırasında STNS mide bir diseksiyon mikroskobu ve mikro diseksiyon araçları (bkz. Şekil 1) kullanılarak elde edilir. STNS STG, özofagus ganglion (RG) ve commissural ganglionlar (cog) yanı sıra mide kasları innerve sinirleri içerir. Burada, ekstrasellüler kayıtları için kullanılan olurdu STG hücrelerin intraselüler ve periferik sinirleri kaydedilen olacak bir elektrofizyoloji deney için hazırlık STNS tam bir diseksiyon nasıl göstermektedir. Somata ve neuropil ortaya çıkarmak için ganglion desheathing bizim teknik olarak istenilen sinirler bulmak için uygun tekniği de gösterilmiştir.
Protokol
1. Brüt Diseksiyon
- Hayvan donuk duyu ve motor sistemlerinin 30 dakika boyunca buz üzerinde bir yengeç yerleştirin. Buz ile her tarafta onu çevreleyen. Yengeç Kullanım sırasında eldiven giyilmelidir.
- Diseksiyonu pan ve kullanacağınız araçları dışarı atarken brüt diseksiyon için hazırlayın. Rongeurs, kemik kesme makası, küçük makas, dişli forseps, konik kenarı ile spatula, siyah Sylgard kaplı çanak, ve böcek pimleri ihtiyaç vardır.
- Sıkışmasını önlemek ve diseksiyon tavada yerleştirmek için, arka bacak buz kovası yengeç çıkartın.
- Içe her bir büküm ilk pençeleri çıkarın. Sonra aynı büküm hareketi her bacak kaldırmak.
- Rongeurs kullanarak, ağız kapsayan maksilla çıkarın. Ayrıca yumuşak maxillule çıkarın.
- Rongeurs kullanarak tekrar karapaksla lateral posterior sonundan itibaren başlamak ve bunun kenar iyi bir kavrama olsun. Kelepçe rongeurs ile aşağı ve karapaksla bir parça kesiyorum. Spatula açılış girmesi için yeterli karapaksta kaldırmak için emin olun. Gözleri karapaksla kenarından yukarı kaldırarak, diğer tarafta devam edin ve işlemi tekrarlayın.
- Spatula sivri tarafı hafifçe dorsal karapaksla çatı uzak yumuşak iç dokusu kazımak. Spatula STNS zarar görmesini önlemek için karapaksta ile temas halinde tutun. Rongeurs dokusundan ayrılmış karapaksla parçaları kurtulmak için kullanın. Ayrıca bazı yumuşak doku karapaksla doku ekleme adduktor kasları ayrı emin olun ventral karapaksla ayırın.
- Karapaksta çıkıntılı iki küçük kemikçikler vardır kalbinde kadar posterior dorsal karapaksla Break Away. Gibi çok ön mümkün olduğunca kesin. Dorsal karapaksla en ön parça terkedip Cephalon ("yüz") bir parmak ile sabitleyin.
- Karapaksla ventral tarafta, onlara ekli epistome mandibula çıkarmak için dışa büküm ve dışarı çekerek, mandibula üzerine rongeurs demir bir zamanda çene kemiklerini bir çekin. İki kasları ile uzun kemikçikler, doğru yapılırsa Ayıklanan mandibula eklenmelidir.
- Spatula ile Gözlere yakın Cephalon iki doku ayırın. Doku tabakası tarafından, olası bir katman olarak kemik parçası sırt yakın kesen küçük diseksiyon makas.
- Diseksiyonu pan bir duvara yengeç istirahat ve yerine o güvenliğini (pençeleri için kullanılan olabilir) desteklemek. Herhangi bir doku eklenmiş bırakmamaya dikkat ederek epistome uzak labrum (üst dudak) kesin. Kemik kesme makası kullanarak Cephalon kaldırmak için ventral karapaksla iki diyagonal kesimler yapmak.
- Dişli forseps ile labrum ve ventral tarafta kemik parçası uzak labium ("alt dudak") kesmek. Sonra yavaşça kalan ventral karapaksla uzak dudak kaldırma. Karapaksla döşeyen doku mide ventral kısmı ayırmak için küçük makas kullanın. Mide yengeç çıkarılan kadar pilorik ampullae görünür olduğunda, bunun her iki tarafta doku uzak mide kesmek.
- Yine de, elin avuç içi karşı mide dinlenme ve ağız içine tuzlu su dökün, forseps ile dudak mide tutarak. Bu mide genişler ve daha kolay açık kesmek için yapar. Aşağı pilorusta ampullae arasındaki kemik parçası ile sağ arasındaki ağız açılması kesin. Sonra iki Kardiyal şubeleri aracılığı ile çapraz aşağı kesti. Mide içinde üç diş ipuçları kesti.
- Mide aşağı mide içinde büyük, siyah, Sylgard kaplı tabağa yerleştirin. Beş köşeli hazırlık böcek iğneli pin ve çanak tüm hazırlık çeker (bkz. Şekil 1), soğuk tuzlu su ile doldurun.
2. İnce Diseksiyon
- , Mikro-disseksiyon araçları ince diseksiyon için ihtiyaç vardır. Özellikle, forseps ve yaylı makas tungsten iğne ile bir iğne tutucu yanı sıra ihtiyaç vardır. Net, Sylgard kaplı petri ve bazı ince tel pimleri da hazırlanmış olmalıdır.
- En düşük büyütme başlayarak, ağız açıklığı için kullanılan dudak yakın kapakları aşağı iğneleyerek başlar. Hazırlık gergin yapmak ve diğer alanlarda gerekli her türlü pin pimleri geri kalanı yeniden düzenleyin.
- Hazırlık alt kısmını kapsayan benekli hipodermis dikkatlice kaldırın ve iki beyaz nokta ile hipodermis bir yama bırakarak üzerinden bunu düzeltin.
- Hazırlanması alt yakın sarı, bir tutam, membranöz doku kadar soyun. Mvns zayıf bu doku alt bağlıdırlar. O kadar çekilir gibi sarı doku dikkatlice mvns ayırın. Sarı doku takip ve beyin yanında kesmek.
- Beyin çıkmadan kalın süreçlerini takip uzatmak laterally Bunlar commisural sinirler vardır. Commissural sinir sonuna ulaşıldığında, beynin yan uzak kesilmiş, off-beyaz süngerimsi doku kitle çıkarın.
- Iyonları ve oğulları Cogs buluştuğu yer, iyonları ve oğulları uzunluğu ortaya çıkarmak için kas ve doku kesip.
- Benekli hipodermis yama dönün ve kesti. Bu STG çevreleyen arter bir açıklık bırakmanız gerekir. , Iki kaslar bu kanadını STG ayrı delikten kesin. Bu kasların uçları yukarı kaldırın ve sağ kesim, onları arter ayırmak için alns ve agns maruz altında . Stn üzerinde uzanan kıkırdak olarak kadarıyla yan kasları ayırın.
- Mvns, dgn STG aşağı çevreleyen arter doku kesilip, dvn karşılamak. Lvns dvn Çalışma ve lvns kaplayan beyaz, narin doku kesti.
- Psn hazırlanması alt yakın kemik parçası üzerinde bulun. Psn LVN ve dlvn kavşak bulmak için kullanılabilir.
- Sonraki pyn ve PDN bulmak için dlvn izleyin. Pyn sık sık açılması pilorik ampulla üzerine sarar. PDN dlvn çatal kapalı ve pilorik ampulla ve kardiyo pilorik valf kasları arasındadır. Hazırlık net Sylgard çanak transfer edildiğinde kolayca karışabilir, çünkü bu sinirlerin bağlı bazı kas bırakın.
- Bir kez tüm sinirlerin STNS ve mide, doku ve istenmeyen sinirler arasında kalan herhangi bir bağlantıları, sever ortaya edilmiştir. Dikkatli bir şekilde, herhangi bir cevapsız bağlantıları kesme, mide geri kalanı uzakta STNS hareket.
- Sylgard artık çok yapışkan ya da kuru hissedene kadar Sylgard yüzey üzerinde sürtünme mide dokusu kalan kitle ile açık Sylgard çanak durumu. Sylgard hidrofobik ve Sylgard kaplı çanak bu şekilde şartlandırılmış değilse STNS kuvvetle uyacaktır.
- Çanak bazı soğuk tuzlu su ekleyin. Forseps ile commissural sinirlerin üst ucunu alın ve STNS açık Sylgard çanak getirmek.
- STNS Sylgard üzerine sabitleyin. Commissural sinirler beyin Sever ve Minuten pimleri Cogs dört ucu aşağı ilk sabitlemek için kullanabilirsiniz. Hazırlık IVN Sylgard uzak işaret olup olmadığını kontrol sağ tarafında olduğunu emin olun. STG sağ taraftaki dgn STG altında biraz çıkmalısınız. Sinirin geri kalanı Pin aşağı ince tel iğneler ile sona erer.
- STNS kalan kas veya doku temizleyin.
- Desheath bir iğne tutucu ve biraz bağladım, ince, tungsten iğne kullanarak STG. STG kılıf hücre gövdeleri uzak bir köşesinde küçük bir delik açın ve bu delik kullanmak kılıf katmanları arasındaki almak için. STG neuropil ve hücre organları açığa çıkarmak için ayrılmış bir kılıf kapağı dikkatlice kesin.
- Hücre gövdeleri erişilebilirlik artırmak ve hücre içi kayıtları için STG stabilize etmek için aşağı kılıfı herhangi bir flep Pin. Her sinir gergin ve ekstraselüler bir kayıt (bkz. Şekil 3) aralıklı sağlanması STNS geri kalanı Re-pin.
3. Sonuçlar
- İdeal olan, tüm sinirlerin özellikle çizik ve hasar, kaydedilmiş olacak olanlar ücretsiz olmalıdır. Sinirlerin Yok karışık veya bükülmüş olmalıdır. STG neuropil etrafında bir sakal oluşumu düzenlenen tüm hücrelerin sağlam olmalıdır. Sağlam STNS bilateral simetrik ve bacaklar, kollar ve kafa olarak ön uç olarak mvns lvns bir minyatür gibi görünüyor.
Kısaltmalar:
| STNS | Stomatogastric sinir sistemi |
| STG | Stomatogastric ganglion |
| COG | Commissural ganglion |
| RG | Özofagus ganglion |
| mvn | Ortalama ventriküler sinir |
| iyon | İnferior özofagus sinir |
| oğlum | Üstün özofagus sinir |
| AGN | Ön mide sinir |
| Aln | Anterior lateral sinir |
| dgn | Dorsal mide sinir |
| dvn | Dorsal ventriküler sinir |
| LVN | Lateral ventrikül sinir |
| psn | Arka mide sinir |
| pyn | Pilorik sinir |
| PDN | Pilorik dilatör sinir |
| dlvn | Lateral ventrikül sinirin dorsal dalı |
| IVN | İnferior ventriküler sinir |
Şekil 1: diseksiyon önce mide STNS yaklaşık yerleştirme gösteren diyagram.
Şekil 2:, açık yeşil, mide ve STNS bir yerleşim alt kısmı çeşitli kasların Diyagramı . STG her hücre tipi kasları innerve bilinen listelenir. Bu harita, planlama, belirli bir hücre (nezaket Nadim laboratuar) bir sinyal taşıyan sinir incelemek yararlı olacaktır.
Şekil 3: STNS, hücre içi elektrotlar ve hücre dışı kuyu (Marder ve Bucher, 2007) ile şematik .
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
STNS diseksiyonu bir elektrofizyoloji veya immünohistokimya deney, ya da hücre hücre kültürü elde etmek için yerine ilk adımdır. Amaçlanan deney ne olursa olsun, brüt diseksiyon değişmeden kalır. Ancak, ince diseksiyon değişebilir. Öncesinde kayıt hücreleri ve sinirler zaman planı için önemlidir. STG nöronların çoğu mide en az bir kas innerve (bkz. Şekil 2) ve innerve hedef göre sınıflandırılır süreçleri var. Bu nedenle, ekstraselüler kayıtları tam intraselüler kaydedilmiş olan bir hücre kimliğini doğrulamak için gerekl...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Teşekkürler
Biz minnetle Marder Lab üyeleri kabul etmiş oluyorsunuz. Danışmanı Dr. Havva Marder, Biz ona destek ve cesaret için teşekkür ederim. Bu araştırma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Hibeler NS-17.813 ve NS-058.110 Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar | |
|---|---|---|---|---|
| Siyah Sylgard 170 | Diğer | Dow Corning | 170 | Kaba Diseksiyon |
| İnce Makas | Cerrahi | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Böcek İğnesi boyut 6 | Cerrahi | Fine Science Tools | 26000-65 | |
| Mayo Makası | Cerrahi | Fine Science Tools | 14110-17 | |
| Mikro-Spatula | Cerrahi | WARD’s Natural Science | 15 V 4313 | |
| Rongeur | Cerrahi | Fine Science Tools | 16000-14 | |
| Doku Penseti | Cerrahi | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| İnce Tungsten Tel (0.001 in. çapında) | Cerrahi | California Fine Wire Company | İnce Diseksiyon | |
| Penset #5 | Cerrahi | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Minuten İğneleri | Cerrahi | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Moria Yaylı Makas (7mm bıçaklı) | Cerrahi | Fine Science Tools | 15370-52 | |
| Petri Kabı (100x15mm) | Diğer | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| İğne Tutucu | Cerrahi | Fine Science Tools | 26018-17 | |
| Süper ince penset #5SF | Cerrahi | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Sylgard 182 | Diğer | Dow Corning | 182 | |
| Tungsten İğneler | Cerrahi | Fine Science Tools | 10130-05 | |
| Diseksiyon Mikroskobu | Mikroskop | Wild | MC3 | Çeşitli |
| Jonah Yengeci (C. borealis) | Hayvan | Commercial Lobster |
Kaynaklar
- Harris-Warrick, R. M., Marder, E., Selverston, A. I., Moulins, M. Dynamic Biological Networks: The stomatogastric nervous system. , MIT Press. Boston. (1992).
- Marder, E., Bucher, D. Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs. Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).
- Maynard, D. M., Dando, M. R. The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus Americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean). Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268 (892), 161-220 (1974).
- Selverston, A. I., Russell, D. F., Miller, J. P. The Stomatogastric Nervous System: Structure and function of a small neural network. Prog. Neurobiology. 7, 215-290 (1976).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
