$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Protokol
Bölüm 1: mikroenjeksiyon için hazırlık
- Sutter Aletleri iğne çektirmenin kullanarak kılcal iğneler çekerek enjeksiyon için hazırlayın.
- (Teksas Kırmızı Dextran'ın gibi) floresan boya ile iğne doldurun.
- Iğne mikromanipülatör ve mikroenjeksiyon cihazları monte edin.
- Eğimli bir ipucu oluşturmak için uygun büyüklükte iğne bir açıyla kesin.
- Damla boyutu ölçün ve petrol enjeksiyon başına 1-2nl arasında olduğunu kontrol edin.
Bölüm 2: embriyoların hazırlanması
- Embriyoların ilgi aşamasında daha 30 dakika önce enjekte edilir. Örneğin, 24 saat sonra döllenme (hpf) ventriküllerin çalışma, 23.5 hpf embriyolar enjekte edilir. Sahne Kimmel ve ark göre, embriyolar. (4).
- Stereomikroskop altında, forseps kullanarak embriyoların dikkatle koryon çıkarın.
- % 1 agaroz ile kaplı plastik tabak, plastik 1-200 ul pipet ucu ile agaroz delik karıştırmak. Forseps kullanarak deliklerden agaroz fişler dikkatlice çıkarın.
- Agaroz delikli çanak içine embriyolar embriyo medya aktarın.
- Medya ekle tricaine Westerfield (5) göre yapılan embriyoların uyutmak ve deneme sırasında hareket etmesini önlemek için.
- Deliğin içine embriyo kuyruk hafifçe aşağı gelecek şekilde yerleştirin ve böylece enjeksiyon cihazı embriyonun arka tarafında yönlendirmek bu.
Bölüm 3: beyin ventrikül enjekte
- Beyin ventrikül enjekte etmek, iğne ucu, aynı alanda yüksek güç embriyo olarak böylece mikromanipülasyon kurulum düzenliyoruz.
- Dikkatlice aşağıdaki beyin dokusu vurmadan r0/r1 hingepoint sadece arka Beyin ince roofplate iğne koymak.
- Enjekte ventriküller tamamen doldurmak için yeterli boya. Embriyo aşamasına bağlı olarak, ventrikül boşluğu doldurmak için çeşitli enjeksiyonlar sürebilir.
Bölüm 4: Görüntüleme
- Kullanarak, temiz bir% 1 agaroz kaplı çanak çanak yeni delikler karıştırmak, fişlerin kaldırmak ve embriyoların uyutmak ve hareket etmesini önlemek için tricaine ekleyin.
- Ventrikül enjekte embriyo kuyruk, dorsal bir görüntü için delik ve konuma yerleştirin.
- Iletilen ışık kullanarak bir resim çekin.
- EMBRİYO VEYA MİKROSKOBU HAREKET çok kritik.
- Mikroskop ayarları değiştirin ve floresan ışığı ile bir görüntü almak.
- Iletilen ışık ve floresan ışığı ile yanal görüntüleri çekmek için embriyo konumlandırın.
- Photoshop görüntü işleme için TIFF dosyaları olarak kaydedin.
Bölüm 5: Görüntü İşleme
- Photoshop görüntüleri işlemek için, iletilen ışık ve floresan ışığı görüntüleri, aynı pozisyonda alınan aynı embriyo açın. Tüm ayarları her bir resim için aynı olduğundan emin olun.
- Floresan görüntü iletilen ışık görüntü üzerine sürükleyin ve onları tam olarak hizaya.
- Floresan görüntü seçildiğinde, "Resim", "Ayarlamalar, seçme" ve ardından "rengini değiştirme" ve beyaz siyah arka plan değiştirmek.
- Floresan görüntüler tekdüze renkli görünüyor kadar sağ "rengini değiştirin" penceresinde "bulanıklık" faktörü ayarlamak.
- "Katmanlar" penceresinde, bindirme görüntüleri izlemek için "Multiply" seçeneğini seçin. Ventrikül alan görüntü tam olarak iletilen ışık görüntü uyumlu olmalıdır.
- Bu dosya ve herhangi bir diğer görüntüler için tekrar kaydedin.
Temsilcisi Sonuçlar / Sonuç
Yanlış enjeksiyon görüntülerin bir örnek EH içinde gösterilmiştir Uygun ventrikül enjeksiyon görüntüleri, 1 panelleri AD Şekil gösterilmektedir. Uygun enjeksiyonları, keskin kenarları olmayan diffüz boya var. Iğne çok uzak ventrikül içine yerleştirilir ve beyin dokusu vurur altında olduğunda oluşur yanlış enjeksiyon, ventrikül alanı dışında görünür boya ve yumurta sarısında neden olabilir.
Şekil 1. 25 hpf vahşi tip embriyoların ventrikül enjeksiyonları Doğru enjeksiyon yöntemi (AD) ve (EH) yanlış enjeksiyon yöntemi örnek olarak gösterilmiştir. (A, E) Dorsal aydınlık görüntüleri (B, F) ve floresan ve aydınlık görüntülerin gösterildiği hem doğru ve yanlış enjeksiyon yöntemleri için kaplama (C, G) ilgili floresan görüntüler. Oklar, yanlış bir ventrikül enjeksiyon ("Sorun Giderme" bölümüne bakın) nedeniyle beyin ventrikül mekanın ötesinde boya gitti bölgelerde gösterir. Anterior tüm resimlerin sol.
Sorun Giderme:
| Sorun | Çare |
| Iğne ile embriyo Ezici. | Iğne çok künt veya ucu çok büyük. | Yeni bir iğne ile başlayın ve bu kadar geri bozmazlar. Konik sizin iğne gibi keskin bir şırınga iğnesi yapmak. |
| Boya (bkz. Şekil 1E-H), embriyo ve yumurta sarısı boyunca. | İğne doku geçti ve ventrikül boşluk kalmadı. | Iğne yeteri kadar keskin olmayabilir, ponksiyon hızını kontrol etmek mümkün değildir. |
| Boya önbeyin çok zayıf ya da değildir. | Enjeksiyon için yeterince yüksek bir basınç kullanmayın, ya da iğne kadar boya enjekte edildiğinde önbeyin ulaşmak için yeterli ön değildi. | Enjeksiyon basıncı artırın ya da enjeksiyon sırasında iğne biraz daha ön yerleştirin. Daha ayrıntılı önbeyin gerekli ise orta beyin arka beyin sınır boyunca iğne koyabilirsiniz. Ayrıca, sadece ileri görüntüleme önce diffüz boya için biraz bekleyebilir. |
| Fluoresan görüntüler Photoshop renk değişiminden sonra kenarlarında koyu. | Renk değiştirme penceresinde "bulanıklık" ayarını değiştirmek için unuttum. | "Bulanık" renk değiştirme penceresi doğru şekilde hareket ettirin. |
| Iğne Beyin roofplate değil. | Iğne düzgün kesilmiş değildir. | Yeni bir iğne olun. Enjeksiyon yapıyoruz, mat gibi çeşitli iğneler gerekebilir. |
Neden