Belirli doku tiplerinin hücreleri Dissociating doku ajitasyon için belirli parametreler uygulanabilir kültürlenebilen hücrelerinin yüksek ses elde etmek için gereklidir. Miltenyi gentleMACS dissociator basit, pratik bir protokol ile bu görevi en iyi hale getirir. Bu yayında akciğer dokusunda bu cihazların kullanımı açıklanmıştır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Standardize Hazırlık gentleMACS Dissociator kullanarak Fare Akciğer Doku Tek Hücre Cezalar
Bu makalede
Özet
Özet
Dokuların tek hücre süspansiyonları hazırlık hücre araştırmalarında birçok deneyler için önemli bir ön koşuldur. Bütün organlar dissociating süreci, tekrarlanabilir bir şekilde yüksek bir sayıda canlı hücreleri elde etmek için belirli parametreler gerektirir. GentleMACS Dissociator basit, pratik bir protokol ile bu görevi en iyi hale getirir. Cihaz fare akciğerler dahil olmak üzere çeşitli doku tipleri, verimli ama nazik ayrılma için optimize edilmiş, önceden programlanmış ayarları içerir. Bu yayında farelerden elde edilen akciğer dokusunda gentleMACS Dissociator kullanımı gösterilmiştir.
Protokol
Steril koşullar altında çalışmak için, bir laminer akış kaputun içindeki tüm adımları gerçekleştirmek için tavsiye edilir.
1. Malzemeler
- HEPES tamponu: 10 mM HEPES-NaOH pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 mM MgCl 2, 1.8 mM CaCl 2)
- Kollajenaz D çözüm: kollajenaz D: 100 mg / ml (kollajenaz D> 0.15 U / mg) Hepes, tampon
- DNaz I çözüm: 20.000 U / ml DNaz I
- PBS pH 7,2
- PEB tampon: 20 kısım 1 kısım BSA Stok Çözüm Çözüm Durulama autoMACS
- Doku: 6 / 7 hafta eski komşu organlara yetişkin erkek BALB / C fare, ikinci elde edilen akciğer.
- İsteğe Bağlı: CD11c mikro, MACS MS Sütunlar fare akciğer tek hücre süspansiyonu dendritik hücrelerin izolasyonu için MACS Ayırıcı
2. Akciğer dokusu Dissociating
- Eritrositler kaldırmak için PBS içeren bir Petri kabındaki doku durulayın.
- 4.9 mL HEPES tamponu içeren bir gentleMACS C Tüp maksimum 450 mg akciğer dokusunda bir aktarın.
- 2 mg / ml kollajenaz D. nihai konsantrasyonu 100 mcL kollajenaz Ge çözüm
- 150 mg doku (40 U / ml DNaz I final konsantrasyon) veya 150-450 mg akciğer dokusunda için 20 mcL DNaz I (80 U / ml DNaz I final konsantrasyon) için 10 mcL DNaz I çözüm ekleyin.
- Sıkıca C Tüp yakın ve gentleMACS Dissociator üzerine ekleyin. Sonra programı çalıştırın "m_lung_01".
- 37 ° 30 dakika ° C'de otomatik rotasyon veya elle her 5 dakikada bir dönüm.
- GentleMACS Dissociator örnek dönün ve "m_lung_02" programı çalıştırın.
3. Süzme
- 70 mikron mesh hücre süzgecinden kap değiştirerek filtre hücreleri toplamak için 50 ml tüp hazırlayın.
- Sonra ikinci gentleMACS Programı tüp örnek malzeme dağıtımı bağlı olarak, biter, tüpün alt kısmında örnek malzeme toplamak için kısaca tüp santrifüj olabilir.
- Uygun bir 1000 ul pipet kullanarak C Boru septum kapalı kap aracılığıyla hücreleri hücre süzgeç çıkarın ve bunları uygulamak.
- RT 5 ml HEPES tamponu ile hücre süzgeç yıkayın.
- 10 dakika 300xg 50 ml tüp hücreleri bir pelet Santrifüj.
- Süpernatantı aspire ve PEB tampon istenen hacmi hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin.
Bölüm 4: Temsilcilik Sonuçları:
Şekil 1: Akciğer disosiasyon gentleMACS ™ Dissociator% 92 canlı hücreler ile sonuçlandı. Ölü hücreler floresan propidium iyodür (PI (); PI boyama sol nokta arsa sağ nokta arsa) ile boyandı.
Şekil 2 fare akciğer dokusunun canlı lökosit ve endotel hücreleri yüksek oranda gentleMACS Dissociator sonuçlarını kullanarak Ayrılma. CD45-PE ve CD146-FITC veya CD31-FITC kökenli tek hücre süspansiyonları ile boyandı ve flow sitometri ile analiz edildi.
Şekil 3 fare akciğer dokusundan elde edilen tek hücre süspansiyonu CD11c-FITC ve Anti-mPDCA-1-APC fare CD11c düşük m-PUKÖ-1 + plazmasitoid DC'ler yanı sıra CD11c yüksek hücreleri algılamak için boyandı .
Şekil 4 CD11c mikro, MiniMACS Ayırıcı ve iki MS Sütunlar kullanarak dendritik hücrelerin zenginleştirilmesi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu video, fare akciğer dokusunun ayrışma için yeni bir yöntem tanıtmak. Biz akciğer dokusunun mekanik ve enzimatik tedavi bir arada yaşayabilir lökosit ve endotel hücreleri yüksek oranda vermiştir olduğunu göstermektedir. Özellikle, doku mekanik parçalanması gentleMACS Dissociator tarafından elde edildi. Stator sistemi, yumuşak bir şekilde ayrışmaktadır doku gentleMACS C Tüpler bir rotor. Bu prosedür, cihazın program ayarları tarafından kontrol edilir. Ayarları, yüksek verim ve hücre canlılığı elde etmek için optimize e...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, bu makalede kullanılan cihazı üreten Miltenyi Biotec GmbH şirketinin çalışanlarıdır.
Teşekkürler
Yazarlar Miltenyi Biotec GmbH, Almanya çalışanları.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
Kaynaklar
- Swanson, K. Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function. J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).
- Vermaelen, K., Pauwels, R. Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights. Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
