$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Steril koşullar altında çalışmak için, bir laminer akış kaputun içindeki tüm adımları gerçekleştirmek için tavsiye edilir.
1. Malzemeler
- HEPES tamponu: 10 mM HEPES-NaOH pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM KCI, 1 mM MgCl 2, 1.8 mM CaCl 2)
- Kollajenaz D çözüm: kollajenaz D: 100 mg / ml (kollajenaz D> 0.15 U / mg) Hepes, tampon
- DNaz I çözüm: 20.000 U / ml DNaz I
- PBS pH 7,2
- PEB tampon: 20 kısım 1 kısım BSA Stok Çözüm Çözüm Durulama autoMACS
- Doku: 6 / 7 hafta eski komşu organlara yetişkin erkek BALB / C fare, ikinci elde edilen akciğer.
- İsteğe Bağlı: CD11c mikro, MACS MS Sütunlar fare akciğer tek hücre süspansiyonu dendritik hücrelerin izolasyonu için MACS Ayırıcı
2. Akciğer dokusu Dissociating
- Eritrositler kaldırmak için PBS içeren bir Petri kabındaki doku durulayın.
- 4.9 mL HEPES tamponu içeren bir gentleMACS C Tüp maksimum 450 mg akciğer dokusunda bir aktarın.
- 2 mg / ml kollajenaz D. nihai konsantrasyonu 100 mcL kollajenaz Ge çözüm
- 150 mg doku (40 U / ml DNaz I final konsantrasyon) veya 150-450 mg akciğer dokusunda için 20 mcL DNaz I (80 U / ml DNaz I final konsantrasyon) için 10 mcL DNaz I çözüm ekleyin.
- Sıkıca C Tüp yakın ve gentleMACS Dissociator üzerine ekleyin. Sonra programı çalıştırın "m_lung_01".
- 37 ° 30 dakika ° C'de otomatik rotasyon veya elle her 5 dakikada bir dönüm.
- GentleMACS Dissociator örnek dönün ve "m_lung_02" programı çalıştırın.
3. Süzme
- 70 mikron mesh hücre süzgecinden kap değiştirerek filtre hücreleri toplamak için 50 ml tüp hazırlayın.
- Sonra ikinci gentleMACS Programı tüp örnek malzeme dağıtımı bağlı olarak, biter, tüpün alt kısmında örnek malzeme toplamak için kısaca tüp santrifüj olabilir.
- Uygun bir 1000 ul pipet kullanarak C Boru septum kapalı kap aracılığıyla hücreleri hücre süzgeç çıkarın ve bunları uygulamak.
- RT 5 ml HEPES tamponu ile hücre süzgeç yıkayın.
- 10 dakika 300xg 50 ml tüp hücreleri bir pelet Santrifüj.
- Süpernatantı aspire ve PEB tampon istenen hacmi hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin.
Bölüm 4: Temsilcilik Sonuçları:
Şekil 1: Akciğer disosiasyon gentleMACS ™ Dissociator% 92 canlı hücreler ile sonuçlandı. Ölü hücreler floresan propidium iyodür (PI (); PI boyama sol nokta arsa sağ nokta arsa) ile boyandı.
Şekil 2 fare akciğer dokusunun canlı lökosit ve endotel hücreleri yüksek oranda gentleMACS Dissociator sonuçlarını kullanarak Ayrılma. CD45-PE ve CD146-FITC veya CD31-FITC kökenli tek hücre süspansiyonları ile boyandı ve flow sitometri ile analiz edildi.
Şekil 3 fare akciğer dokusundan elde edilen tek hücre süspansiyonu CD11c-FITC ve Anti-mPDCA-1-APC fare CD11c düşük m-PUKÖ-1 + plazmasitoid DC'ler yanı sıra CD11c yüksek hücreleri algılamak için boyandı .
Şekil 4 CD11c mikro, MiniMACS Ayırıcı ve iki MS Sütunlar kullanarak dendritik hücrelerin zenginleştirilmesi.