Yöntem makalesi

İnsan CD40 aktive B hücreleri üretilmesi

15K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/1373

⸱

16 Ekim 2009

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Tumor and Transplantation Immunology and Stem Cell Transplantation Program, University Hospital of Cologne, Department I of Internal Medicine

Bu makalede

Özet

Bu video mevcut Ex vivo Insan CD40 aktive B hücreleri, CD40 ligand ve interlökin-4 ile stimülasyon periferik kan mononükleer hücreleri (hücre) üretimi ve genişleme (CD40-B).

Özet

CD40-aktive B hücreleri (CD40-B hücreleri) immüno-uyarıcı antijen sunan hücreler (APC), kanser immünoterapi için 1-3 alternatif bir kaynak olarak tespit edilmiştir . CD40-B hücreleri birkaç farklı biyolojik ve teknik özellikleri Dendritik hücreler (DH), en iyi karakterize APC ile karşılaştırıldığında. DC'ler benzer şekilde, B hücreleri MHC ve co-uyarıcı moleküller (Fig.1b) artmış ekspresyonu, interlökin-4 ve CD40 ligand (CD40L) ile stimülasyon sonra, güçlü bir göçmen kapasite ve mevcut antijen sunumu T hücrelerinin verimli sergilerler. Ancak, olgunlaşmamış ya da olgun DC'ler aksine, CD40-B hücreleri CD62L, CCR7/CXCR4 oluşan tam bir lenf nodu homing üçlüsü ifade ve ikincil lenfoid organlara homing gerekli lökosit fonksiyon antijen-1 (LFA1, CD11a/CD18) (Fig.1a) 3 CD40-B hücreleri, periferik kanda çok az miktarda daha yüksek saf CD40 B hücreleri sağlıklı donörlerden (> 10 9 hasta başına hücreleri) yanı sıra kanser çok büyük miktarda in vitro açılabilir zorluklar olmadan oluşturulabilir hasta (Fig.1c d) 1,4.

Bu protokol, insan hücre tamamen aktif CD40-B hücreleri nasıl elde göstermektedir. Hücre kültürü için anahtar moleküller CD40 ligand, interlökin-4 (IL-4) ve siklosporin A (CsA), 3-4 günde bir kültür döngüsü yenileniyor. Laboratuvar amaçları için CD40 stimülasyon, rekombinant insan CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5 ifade NIH/3T3 hücreleri tarafından sağlanmaktadır . -Transfekte olmayan hücreleri ile kirlenmesini önlemek için, transfektanları insan CD40 ligand ekspresyonu (Şekil 2) düzenli olarak kontrol edilmelidir.

14 gün sonra CD40 B hücre kültürleri fazla% 95 saf B hücreleri CD40-B hücreleri ve 65 gün içinde bir genişleme sık fonksiyonu 1, 4 herhangi bir kayıp olmaksızın mümkün oluşur. CD40-B hücreleri verimli, süreç kadar sürebilir ve T hücrelerinin mevcut antijenler 6. Sadece başbakan naϊve değil, aynı zamanda bellek T hücreleri 7,8 genişletmek. CD40 ile aktive olan B hücreleri, B-hücre aktivasyonu, farklılaşma ve fonksiyon çalışma için kullanılabilir. Ayrıca, tümörler 9 karşı tedavi veya önleyici aşı için umut verici bir aracı temsil eder.

Protokol

PBMC insan CD40 aktive B hücreleri üretimi için protokol iki bölüme ayrılmıştır: Kısım A plaka bağlı besleyici hücreler olarak kullanılacaktır NIH/3T3 hücreleri, CD40 ligand ifade hazırlanmasında gösteriyor. Bölüm B, gerçek CD40-B kültür açıklar.

A. besleyici hücreler Hazırlama (tCD40L NIH/3T3)

TCD40L NIH/3T3 tamamen konfluent haline asla yapışkan bir fare fibroblast hücre hattı,. Hücreler bu nedenle haftada iki kez parçalı. Daha fazla 6 hafta içinde Kültürleme tavsiye edilmez.

  1. Steril bir pipet ile primer kültür eski orta çıkarın ve 10 ml 1x PBS ile yıkayın hücreleri. PBS ile yıkandıktan sonra aspire.
  2. 37 °, 5-10 dakika için 75 cm 2 balon 4 ml tripsin / EDTA ° C Hücreleri ayırmak için hafif dokunarak kullanın.
  3. Vahşi tip orta 10 ml ekleyin ve hafifçe dönebilen.
  4. Hücre süspansiyonu steril bir pipet yardımıyla 50 ml tüp içine aktarın ve 5 dakika boyunca 225 xg'de hücreleri aşağı döndürün.
  5. Süpernatantı ve vahşi tip orta 10 ml pelet tekrar süspansiyon haline getirin. Hücre süspansiyonu bir kısım hücre sayısı sayın ve uygun sayıda hücre ile üç 50 ml tüpler hazırlamak:
    1. Alt kültüre için 1.5 x 10 6 hücre
    2. 0.2 x 10 6 hücre / CD40 B hücre kültürü için kullanılan ışınlama
    3. dondurmak için geri kalan (gerekirse).
  6. 5 dakika boyunca 225 xg'de hücreleri aşağı spin.
  7. Süpernatantı.
    1. Alt kültüre için tekrar süspansiyon 75 cm 2 hücre kültürü şişesi 10 ml vahşi tip orta (hücre yoğunluğu 1.5 x 10 5 hücre / ml) 1.5 x 10 6 hücre, G-418 [0.7 mg / ml] ve hücrelerin inkübe % 5 CO 2 ile 37 ° C. Haftada iki kez hücreleri bölün.
    2. CD40 B hücre kültürü için bir adet 6-plaka için 1.2 x 10 6 hücre gerekir. 0.1 x 10 6 hücre / mL yoğunluğu vahşi tip orta hücrelerin yeniden süspanse edin ve 78 Gy ışın tedavisi. Yanı sıra, her 37 ° inkübe ° C ile% 5 CO 2 hücre süspansiyonu Plaka 2 mL. TCD40L NIH/3T3 hücreleri yapışık B-hücre uyarılması için hazırlanmış tabak kullanın (en az 4 saat: mikroskop ile bağlılık kontrol edin; B-hücre stimülasyon başlatmak için 24 saat daha beklemek gerekmez). (B. devam)

B. CD 40-B hücre kültürü

CD40 stimülasyon (gün 0) PBMC'ler I. Hazırlık:

Lütfen dikkat: besleyici hücreler yapışık olduğu tespit devam etmeden önce. Interlökin-4 ve siklosporin besi kullanımdan hemen önce taze çözümler her zaman ekleyin.

  1. , Taze veya uygun bir şekilde çözülmüş ya PBMC'ler alın. Süspanse edin, iki kez yıkayın ve ilk kez 7 dakika ve diğer hücreleri çıkarmak için ikinci kez 7 dakika süreyle 190 xg'de 265 xg'de aşağı spin 50ml 1x PBS PBMC'ler. Süpernatant atın ve 20 ml PBS hücrelerin tekrar süspansiyon. Hücre süspansiyonu bir kısım hücre sayısını belirler.
  2. 5 dakika boyunca 225 xg'de hücrelerin gerekli miktarda aşağı spin. 6 plaka 4 x 10 6 hücre / kuyu, böylece plaka başına 24 x 10 6 hücre ihtiyaç vardır.
  3. T-hücrelerinin büyüme faktörü ve 0,63 mg / ml siklosporin gibi bir akıbet önlemek için 1 x 10 6 hücre / ml taze interlökin-4 50 U / ml ile desteklenmiş CD40-B kültür ortamı PBMC tekrar süspansiyon süpernatantı (Verilen konsantrasyonları bir ml kültür ortamı bakın!).
  4. Süpernatantı 6-plaka ön tCD40L NIH/3T3 hücreleri ile inkübe.
  5. 2 ml PBS başına ilk ve CD40-B yıkama orta 2 mL ikinci bir adımda yapışık tCD40L NIH/3T3 hücreleri yıkayın.
  6. 6-plaka Her iyi yavaşça PBMC süspansiyon 4 ml (1 x 10 6 hücre / ml) ekleyin.
  7. 37 hücreleri inkübe ° C ile% 5 CO 2.
  8. 7 gün, hücreleri (3.2 ile devam edin.) Reculture.

II. CD40-B hücreleri (7 gün ve daha sonra her 3-4 gün) Recultivation:

  1. 50 ml tüp içine 10 ml pipet ve havuz onları resuspending 6-plaka CD40-B hücreleri Harvest kümeleri.
  2. 7 dakika boyunca 225 xg'de Spin ve süpernatant tamamen CD40-B yıkama orta yerine. Bir kısım hücre miktarını sayma, 5 dakika boyunca 225 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün. 1 x 10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon CD40-B kültür ortamında süspanse edin CD40-B hücreleri.
  3. 50 U / ml konsantrasyonu ve 0.63 mg / ml orta siklosporin A interlökin-4 taze çözümler ekleyin.
  4. 6 plaka tCD40L NIH/3T3 hücreleri önceden inkübe süpernatantı.
  5. 2 ml PBS başına ilk ve CD40-B yıkama orta 2 mL ikinci bir adımda yapışık hücrelere yıkayın.
  6. yavaşça 4 mL, 6-plaka her kuyuya CD40-B süspansiyon (1 x 10 6 hücre / ml) .
  7. 37 ° plakaları inkübe ° C,% 5 CO 2 .
  8. Altkültür hücreleri yeniden her 3-4 günde bir toplam 14 gün sonra son derece saf bir insan CD40 aktive B hücreleri ile sonuna kadar.

C. Sorun Giderme - CD40-B hücreleri büyümek yoksa?

  1. Besleyici hücreler CD40 ligand ifade için kontrol ettiniz?
  2. Plaka bağlı uyarılması için kullanılan besleyici hücreler 24 saat daha büyük olması gerekmez mi?
  3. Mycoplasma mümkün olan bir kirlenme mi?
  4. Interlökin-4 çözüm takviyesi için kullanılan, taze çözülmüş ve uygun biyolojik aktivite vardı?
  5. Siklosporin A doğru konsantrasyon eklendi?

figure-protocol-1
Şekil 1: Lütfen burada Şekil 1'de bir büyük versiyonu için tıklayın .

figure-protocol-2
Şekil 2 Lütfen buraya tıklayın Şekil 2 daha büyük bir versiyonu için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

A. Medya Hazırlanışı:

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Besleyici hücre vahşi tip orta Besleyici hücre seçimi orta
Reaktif Konsantrasyon Reaktif Konsantrasyon
DMEM-Ham / F12 DMEM-Ham / F12
L-Glutamine 365 mg / ml L-Glutamine 365 mg / ml
FBS % 10 FBS % 10
Hepes 10 mM Hepes 10 mM
Gentamisin 15 mcg / mL Gentamisin 15 mcg / mL
G-418 0,7 mg / ml
CD40-B yıkama orta CD40-B kültür ortamı
Reaktif Konsantrasyon Reaktif Konsantrasyon
IMDM
IMDM
L-Glutamine 584 mg / ml L-Glutamine 584 mg / ml
Hepes 25 mM Hepes 25 mM
Gentamisin 15 mcg / mL Gentamisin 15 mcg / mL


rh Transferrin 50 mcg / mL


rh İnsülin 5 mg / ml


AB-Humanserum % 10

B. Çeşitli Reaktifler:

Reaktif Şirket Hiçbir sipariş
DMEM / Ham Kullanıcı F12 PAA Cat No: E15-813
IMDM Invitrogen Gibco ® REF 21980-032
Dulbecco'nun PBS (10x) PAA Kedi No H15-011
AB-İnsan Serum Invitrogen Kedi yok 34005100
Holo-Transferrin insan Sigma Kedi yok T0665
İnsülin insan Sigma Kedi yok I2643
Gencin ® Delta seçin Art No 7395800
Rekombinant İnsan İnterlökin-4 Immunotools Kedi yok 11130045
Bir Siklosporin Novartis Kedi yok NDC 0078-0109-01
FBS Lonza Kedi yok DE14-802C
Hepes Tampon PAA Kedi yok S11-001
G-418 Sülfat PAA Kedi No P02-012
Tripsin / EDTA (10x) Invitrogen Gibco ® REF 15400-054

C. Çeşitli Sarf Malzemeleri:

Reaktif Şirket Hiçbir sipariş
Steril pipet uçları Sarstedt
6-plaka Nunc Kedi yok 140.675
50ml konik tüp BD Falcon ™ Kedi yok 352.070
Doku kültürü şişesi Sarstedt Kedi yok 83.1813.002

Kaynaklar

  1. Schultze, J. L. CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy. J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).
  2. Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy. Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).
  3. Bergwelt-Baildon, M. von CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants. Blood. 107, 2786-2789 (2006).
  4. Wiesner, M. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).
  5. Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma. Blood. 85, 1903-1912 (1995).
  6. Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells. Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).
  7. von Bergwelt-Baildon, M. S. Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application. Blood. 99, 3319-3325 (2002).
  8. Kondo, E. CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential. Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).
  9. Mason, N. J. RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma. Gene Ther. 15, 955-965 (2008).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Periferik Kan Monon kleer H creleriCD40 Ligandnterl kin 4Siklosporin ANIH 3T3 H creleriBesleyici H cre Haz rlamaH cre K lt r Geni letmeAntijen SunumuLenf Nodu Homingi

İlgili makaleler