Horseshoe Yengeç kullanarak, Limulus Polyphemus'un Vizyon Araştırma

Özet

Bu videoda, Amerikalı at nalı yengeci elektroretinogram kayıt, optik sinir kayıt ve intraretinal kayıt gerçekleştirmek Limulus Polyphemus'un. Bu elektrofizyolojik paradigmalar, bir araştırma veya öğretim laboratuvar görme nöral temeli soruşturma için kullanılabilir.

Özet

Amerikan at nalı yengeci, Limulus Polyphemus'un, dünyanın en eski canlıların biridir ve hayvan biyomedikal araştırma vazgeçilmez bir rol oynamaya devam etmektedir . Onların kan değil, sadece bilim adamları ilaçların bacteriotoxins algılamak için kullandığı özel hücreler içeren, ama onların gözleri de ışık adaptasyon ve yanal inhibisyonu gibi fizyolojik süreçleri, görsel sistem faaliyet hakkında daha fazla fikir sağlanan bir sinir ağı yapar. At nalı yengeci, hayvan, büyük ve cesur bir omurgasız olduğundan, retinal nöronların büyük ve kolayca erişilebilir görme araştırma için çekici bir model olmaya devam ediyor, görme sistemi, kompakt ve yoğun çalışılan ve görsel davranış iyi tanımlanmıştır. Ayrıca, gözlerin yapısı ve fonksiyonu, hayvanın beyninde bir sirkadiyen saat bir günlük bazda modüle. Kısacası, at nalı yengeçleri görme sistemi yeterince basit ama ilginç olacak kadar karmaşık anlaşılmalıdır.

Bu video Limulus in vivo olarak yapılabilir görme nöral temelini araştırmak için üç elektrofizyolojik paradigmalar sunuyoruz. Onlar elektroretinogram kayıt, optik sinir kayıt ve intraretinal kayıt. Bir yüzeye sahip elektroretinografi (ERG) kayıtları tedbir, tüm hücreleri bir ışık yanıp sönmeye göz özetlenebilir elektriksel tepki elektrodudur. Onlar zaman uzatmak süreler için göz genel duyarlılığı izlemek için kullanılabilir. Optik sinir kayıtları ekstraselüler microsuction elektrot ile tek sinir liflerinin spike aktivitesini ölçmek. Göz, beyin gibi beyin göz geri beslenen sirkadiyen saat mesajları iletilir görsel mesajları okumak için kullanılabilir. Intrasellüler mikroelektrot İntraretinal kayıtları önlem voltaj dalgalanmaları göz bireysel hücrelerin ışık ile indüklenen. Onlar retina işleme hücresel mekanizmaları aydınlatmak için kullanılabilir.

Protokol

Bölüm 1: Deneysel Hazırlık

At nalı yengeçleri üzerinde yapılan deneysel prosedürleri Boston Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. Hayvanlar düzenlenmiş bir ışık-karanlık döngüsüne maruz kalan bir oda Deniz Biyoloji Laboratuarları (Woods Hole, MA) veya başka bir satıcı satın alınan ve gazlı bir tuzlu su tankı ev sahipliği yapmaktadır. Aydınlatma rejimi yengeç sirkadiyen saat sürükleyici ve gündüz ve gece devletler arasındaki günlük göz bisiklet için önemlidir. Iki paslanmaz çelik zehir yerleştirilen vida ve opisthosoma iki hareketi yavaşladı ve daha sonra tahta bir platform sağlanana kadar hemen hiçbir invaziv işlemler başlamadan önce, hayvan, 10-15 dakika süreyle bir buz kovası soğuk. Su lavabolar, böylece platform granit altında ağırlıklı. Terminal deneylerden sonra hayvan yine buz bulamaç içine çeker ve bir neşter ile ağız yukarıda yer alan beyin, pithing tarafından ötenazi.

Bölüm 2: Çözümler

Limulus Zil Kullanıcı çözümü 430 mm NaCl, 9.56 mM KCl, 9.52 mM CaCl2, 9.97 mM MgCl2, 21.05 mM MgSO4, 50μM TES, 50μM Hepes, ve 10 ml / L Kalem-Strep mix (Penisilin-Streptomisin, 10000 birimleri / ml) oluşur .

Bölüm 3: elektroretinogram Kaydı

Bu prosedür için gerekli araçlar, tornavida, vazelin, Ringer solüsyonu, bir transfer pipeti yeşil bir LED, bir kayıt odası, paslanmaz çelik vida ve bir pamuklu çubukla.

1. Bir el yapımı oda ERG (Şekil 1A) kaydetmek için kullanılır. Odasına vücut, göz ile temas halinde tuzlu su rezervuar tutmak için tasarlanmıştır. Kapak, bir LED barındıracak büyüklükte bir amplifikatör ve küçük bir delik iletken çözüm bağlamak için gümüş klorür tel içerir. 520Nm çevresinde tepe emisyon LED bir yanabilme Ultraparlak iyi çalışır.
2. Başlatmak için, odanın alt vazelin ile kaplı ve iki adet vida ile göz üzerinde güvenli bir.
3. Odasına sonra tuzlu su ile doldurulur ve kapak ile kapatılmış.
4. Odasına eklenti sonra yengeç, solungaçları üzerinde deniz suyu ile doldurulmuş bir tank bir ışık geçirmez kafes yerleştirilir.
5. LED kablo haznesi kapağının içine eklenir.
6. Sinyal kurşun klorür tel kırpılır ve referans kurşun implante vidalar kırpılır.
7. Her iki yol açar sinyal amplifikasyonu ve amplifikatör filtresi 10Hz altındaki frekanslarda geçmek için yüksek empedans diferansiyel amplifikatör başkanı evre (X-cell 3x4, FHC Inc.) Bağlanır.
8. Amplifikatör çıkışı görüntülemek için bir osiloskop ve bilgisayar analizi ve depolanması için bir veri toplama kuruluna beslenir.
9. Kurulumundan sonra kafes kapı, oda ışığında hayvan ulaşmasını engellemek için kapalı.
10. Veri LabView yazılmış özel bir program ile toplanır. Programı, LED yanıp söner, uyarılmış ERG sinyal kayıtları, ve tepeden-tepeye tepki genlik önlemler. Flaş paradigmanın seçim deneysel hedef bağlıdır. Örneğin, kısa bir 5V (100ms) darbe, uygulanan her 10 dakikada bir LED ışık uyum etkileri göz hassasiyeti sirkadiyen değişiklikleri izleme önler.

Bölüm 4: Optik sinir kayıt

Bu işlem için gerekli araçlar, bir tornavida, iplik, trefin, Ringer solüsyonu, rongeurs, vannas makas, bir kayıt odası, kavisli bir forseps, ince iğne probları, sıkıcı bir neşter, cerrahi makas ve bir emme elektrot içerir.

1. Bir el yapımı oda, optik sinir yanıtları (Şekil 1B) kaydetmek için kullanılır. Odasının iç sinir karşılamak ve onu çevreleyen doku izole alt duvarında ince bir yarım daire oluklu açılış 2cm çaplı açık kuyu.
2. 16-gauge iğne oda takmadan önce kalbin içine menteşe kaslar arasındaki eklenir ve kan ~ 20cc hayvan boşaltılır. Exsanguination gerekli değil ama optik sinir diseksiyonu kolaylaştırır.
3. Optik sinir konumu karapaksta lateral ve median gözler arasında hafif kavisli bir çizgi çizerek tahmin edilmektedir.
4. Dairesel bir delik daha sonra bir trefin karapaksta kesilir. Delik de oda olarak aynı çapa. 2-3 cm lateral göz ve sinir iyi ventral kısmı boyunca uzanan hat böylece biraz dorsal anterior deliğin merkezi yer almaktadır.
5. Bağ dokusu, sinir tamamen görünür ve çevresindeki doku ve altta yatan ücretsiz kadar temizlenir.
6. Thread bir iplikçik sinir çevresinde dolanmıştı ve altındaki yuvası ile odasına çekilir. Bu aynı açıklıktan sinir hafifçe dize çekerek odasına yönlendirilir. Aynı zamanda odanın deliğe sokulur. Odasının karapaksta sonra yapıştırılmıştırvida ve iyi Ringer solüsyonu ile doludur.
7. Odasına eklenti sonra hayvan, solungaçları üzerinde deniz suyu ile doldurulmuş bir tank bir ışık geçirmez kafes yerleştirilir.
8. Kuyu Stereoskop (SMZ-168, Jed Pella Inc) ve pamuk odasının içine ya da dışına ve tuzlu kan sızıntısını önlemek için alt açılış etrafında doldurulur altında görüntülenmiştir.
9. Artık sinir çevresinde bağ dokusu ince makas ve cımbız ile kaldırılır ve oda taze Ringer solüsyonu ile doldurulur.
10. Bir nick bu açıklıktan sinir dikkatle, ince makas, cımbız, iğne probları kullanarak uzunluğu boyunca desheathed, sinir kapsüller ve kan damarı yapılır.
11. Küçük bir elyaf demeti, afferent lif kayıt için göz uzak sonunda ve efferent lif kayıt için göze yakın sonunda prob ve kesme kullanarak sinir ayrılır. Video afferent lif kayıtları için son kesilir.
12. Zil çözümü ile dolu bir microsuction elektrot (AM Sistemleri A.Ş.), optik sinir kayıt için kullanılır. Elektrot ucu 1mm çapında borosilikat cam sonuna kapiller parlatma yangın sinir demetine takılmıştır.
13. Elektrot ucu manuel manipülatör (TEFE A.Ş.) ile de odasına indirdi ve kesik elyaf demeti ucu içine çekilir. Emme boru üzerinden elektrot bağlı bir Gilmont şırınga tarafından sağlanmaktadır.
14. Bir BNC bağlantısı sinyal yol sağlar ve gürültüyü azaltmak için elektrot sarılı bir gümüş klorür tel referans kurşun sağlar. İki yol açan sinyal amplifikasyon ve gürültü filtreleme (X-cell 3x4, FHC Inc.) Için bir diferansiyel amplifikatör başkanı sahneye bağlanır. Amplifikatör çıkışı bir osiloskop bilgisayar analizi ve depolama için görüntüleme ve veri toplama kartı gönderilir.
15. Veri LabView yazılmış özel bir program ile toplanır. Program, bir dijital video işlemcisi ile hafif uyaranlara kontrol (Bit + +, Cambridge Araştırma Sistemleri A.Ş.) ve başak trenler kayıtları dijital başak discriminator (APM, FHC A.Ş.) arayüzleri. Işık, bir fiber optik ışık borusu yoluyla ya da tüm göz göz, bilgisayar kontrollü bir video ekranı üzerinden tek hücrelere teslim edilebilir.

Bölüm 5: İntraretinal kayıt

Bu prosedür için gerekli araçlar, bir tornavida, dişli vida delikleri ile L şeklinde Lucite platformu, bir cam pipet ile mikroelektrot tutucu, paslanmaz çelik vidalar, cımbız, ve ince bir neşter.

1. Lucite, önceden ayarlanmış vida deliklerini bir el yapımı tabak intrasellüler yanıtları kaydetmek için kullanılır. Delikleri motorlu mikromanipülatör (PPM5000, TEFE Inc) montaj için aralıklı. Plaka tarafta iki vida ve üstüne bir hayvan eklenir.
2. Plaka eklenti sonra hayvan, solungaçları üzerinde deniz suyu ile doldurulmuş bir tank bir ışık geçirmez kafes yerleştirilir.
3. Micropositioner gözün üzerine dizilen hareketli kol ile plaka içine vidalanır.
4. 1-mm OD borosilikat cam, cam mikropipetler bir parti çekti ve ipuçları 3M KCl çözeltisi küçük bir flakon mikropipetler koyarak kapiller eylem yoluyla yeniden toprakla.
5. Pipetler geri kalanı daha sonra elle tuz çözeltisi ile doldurulur ve bir elektrot tutucu içine yerleştirilir.
6. Elektrot tutucu micropositioner koluna iliştirilmiş bir hücre içi amplifikatör başkanı evre (IR-283, Cygnus Technology Inc) bağlıdır.
7. Retinanın küçük bir bölümü (yaklaşık 1mm2), bir jilet ile kornea arayüzü keserek maruz kalmaktadır.
8. Kurumasını önlemek ve mikropipet ucu retina dokusunun içine açıklığından ileri bir damla Ringer çözeltisi maruz retina üzerine yerleştirilir.
9. Ucu çözüm girdiğinde, hücre içi amplifikatör mevcut enjeksiyon modu devreye girer ve elektrot empedansı ölçülür. 20-70 MW aralığının dışında empedansı ile mikropipetler atılır. Bu aralıkta olanlar mikron adım ileri, elektronik ya da mekanik pipet titreşimli hücre içine kazığa.
10. Üç tip hücrelerin göz karşılaştı olabilir. Retinular hücreleri sadece ışığa karşı bir depolarizan tepki gösterir, eksantrik hücreleri depolarize yanıt sürme aksiyon potansiyelleri bir tren ve pigment hücreleri hiç ışık tepki gösteriyor.
11. Veri Labview yazılmış özel bir program ile toplanır. Programı, bir dijital video işlemci (Bit + +, Cambridge Araştırma Sistemleri) ile hafif uyaranlara kontrol eder. Uyaranlar, bir fiber optik boru veya video gösterimi ile kazığa hücrelerine teslim edilir. Voltaj yanıtları osiloskop gözlenen ve bilgisayar programı tarafından sayısallaştırılmış.

Bölüm 6: Temsilci Sonuçlar

Bir temsilci ERG Şekil 2A gösterilecek. Dalga özetlenebilir elektrik temsil ederöncelikle photoreceptive retinular hücrelerin ışığa tepki, büyük ölçüde eksantrik hücreleri sayıca daha fazla ve elektrikle akuple. Memeli ERG gibi farklı retinal hücre tipleri birden fazla dalga şekli bileşenleri yoktur. Limulus beyinde bir saat Sirkadiyen geribildirim, günlük bazda retina hücrelerinin zaman içinde değişebilir (1) ERG genlik ve zaman içerisinde neden fizyolojik özellikleri modüle eder. Şekil 2B gösterildiği gibi, ERG genlik öznel gün boyunca hayvan öznel gece ve en düşük sırasında en yüksek olduğu.

, Işık tek bir optik sinir lifi yanıtı bir temsilcisi iz Şekil 3'te gösterilmiştir. Eksantrik hücreleri sürekli bir seviyeye bir çürüme tarafından takip başak deşarj oranı geçici bir artış göstererek, kabaca aynı şekilde davranır. Oranı çürüme, ışık uyum ve başak bağımlı self-inhibisyon eksantrik hücreleri (2) birleşik eylem yansıtır. Işık bağımlı oranı azalır gibi diğer başak desen, Limulus beyin görülen ama göz değil (3).

Pigment hücresi, retinular hücre ve eksantrik bir hücrenin ışığa gerilim yanıt Temsilcisi izleri Şekil 4'te gösterilmiştir. Sadece son iki retinal hücre tipleri görsel. Tepki genlik ve zaman ders kayıt kalitesi ve elektrot hücre içindeki yerini bağlıdır. Genellikle, elektrot, büyüklüğü ve sayısı nedeniyle pigment hücreleri veya retinular hücreleri nüfuz eder. Ikincisi, sürdürülebilir bir seviyeye çürükleri geçici bir depolarizasyon kaydedilir. Çürüme retinular hücreleri tarafından hafif adaptasyon (2) kaynaklanmaktadır. Elektrot eksantrik hücre girerse, büyük aksiyon potansiyelleri, akson (40-70mV) ve soma (<25mV) yakın bir depolarizan dalga şekli sürme küçük aksiyon potansiyelleri kaydedilir.

Şekil 1 elektroretinogram kayıt (A) ve optik sinir kayıt (B) için kullanılan odaların şematik diyagramları. Bar 7mm eşittir B. A ve 5mm

Şekil 2. Örnek bir 100ms tarafından uyarılmış bir Limulus ERG izleme karanlıkta 5V nabız (A) ve sürekli karanlıkta zamanla ERG genlik tepe tepe dalgalanması (B) LED. Karanlık beyaz üçgen tarafından belirtilen süre başlandı. ERG genlik siyah üçgen tarafından belirtilen zaman içinde büyüme ışık adaptasyon, karanlıkta göz hassasiyetini artırır. ERG genlik siklik değişkenlik bundan sonra hayvanın iç sirkadiyen saat nedeniyle. B Zaman her 5min.

Şekil 3 Örnek bir optik sinir lifi yanıt iz, tek bir ommatidial reseptör parladı ışık . Iz üzerinde Waveform uyaran zamanlama gösterir. Aksonlar sinir lifleri doğuran Eksantrik hücreler, tüm aydınlatma koşulları altında deney (toplam karanlıkta 5sn flaş) bu kadar ateş benzer bir model göstermektedir. Retina kodlama ile ani bir özellik Limulus diğer omurgasızlar aksine, memeliler ile ortak.

Şekil 4 gerilim yanıt Örnek izleri Limulus lateral göz bulunan üç hücre tiplerinin ışık: pigment hücresi (A), retinular hücre (B) ve eksantrik hücre (C) . Ilk hücre görsel olmayan. Son iki ışık yanıp üzerine depolarize. Işık transduce ve eksantrik bir hücreye gap junction ile sinyal göndermek için depolarizasyon yol boyunca bazı kaybı, retinular hücreler için büyük. Eksantrik hücre, akson tarafından ateş aksiyon potansiyelleri soma içine başak geri yayılım nedeniyle depolarizasyon sürme görülür. Aksiyon potansiyellerinin genlik depolarizan potansiyeli daha iyi görüntüleme için bu rakam zayıflatılmış olmuştur. Hücrelerin dinlenme potansiyeli-50mV.

Tartışma

Biz, ERG kayıtları, optik sinir kayıtları ve in vivo olarak at nalı yengeçleri intraretinal kayıtları nasıl gerçekleştirebileceğimizi gösterdi var. Kayıt teknikleri her nöral temeline ilişkin vizyon, farklı bakış açıları sağlamak ve hepsi yengeç büyük gözleri ve sert karapaksla canlı hayvanlar sayesinde retina fonksiyonunu incelemek için kullanılabilir. Optik sinir aktivitesi elektrot uygun inşaat (4) ile özgürce okyanus hayvanları davranmaya bile kaydedilebilir. Bu teknikler, aynı zamanda kurulum küçük değişiklik ile e...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
LED	Işık kaynağı	Newark Inc	33C1292
Vakum elektrodu	Elektrot	A-M Systems	573000
XCell 3*4 Kanallı Ekstrasellüler Amplifikatör	Amplifikatör	FHC, Inc.	40-40-8B
Hücre İçi Kayıt	Amplifikatör	Cygnus	IR-283A
APM	Nöral Spike Ayırıcı	FHC, Inc.	APM
Bits++	Video Panosu	Cambridge Research Systems	Bits++
Piezoyama Manipülatörü	Mikrokonumlandırıcı	World Precision Instruments, Inc.	PPM5000
Kare Dalga Stimülatörü	Sinir Stimülatörü	Ot Teknolojileri	Model S48
P-97	Mikropipet Çekici	Sutter Instrument Co.	Model P-97
Borosilikat Cam Kılcal Boru	Elektrot camı	World Precision Instruments, Inc.	1B150-4
Atlar– yengeç (Limulus polyphemus)	Hayvan	Deniz Biyoloji Laboratuvarları
Mikropipet Çekici	Cam Çekici	Sutter Instrument Co.	P-97
Zoomlu Stereoskop	Mikroskop	Jed Pella Inc.	SMZ-168