Yöntem makalesi

Fare Periton Boşluk Hücreleri İzolasyon

146.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/1488

⸱

28 Ocak 2010

 , 
1BloodCenter of Wisconsin, Blood Research Institute

Bu makalede

Özet

Periton boşluğuna memelilerde doğuştan gelen bağışıklık yanıtları için çok önemli olan farklı bağışıklık hücre popülasyonlarının içerir. Verimli bir izolasyon yöntemi, bu hücrelerin biyokimyasal ve fonksiyonel analizler için gereklidir. Burada fare periton boşluğuna hücrelerin izolasyonu için kapsamlı bir yöntem sağlar.

Özet

Periton boşluğuna memelilerin karaciğer, dalak, mide-bağırsak ve diğer iç organları içeren bir membran-bağlı ve karın boşluğunda sıvı dolu. Bu bağışıklık hücreleri, makrofajlar, B hücreleri ve T hücreleri de dahil olmak üzere bir dizi barındırıyor. Periton boşluğunda naif makrofajlar yüksek sayıda varlığı naif doku ikamet eden makrofaj (1) toplanması için tercih edilen bir site yapar. Peritoneal kavite varlığı nedeniyle geleneksel B2 hücrelerine ek olarak B1 hücreler olarak bilinen eşsiz bir periton boşluğuna yerleşik B hücre alt B hücreleri çalışma için önemlidir. B1 hücreleri CD11b ve CD5 yüzey ifadesi ile ayırt edilebilir B1a ve B1b hücreleri, bölünmüştür. B1 hücreleri çeşitli patojenler (2-4) bir erken koruma sağlayan doğal IgM önemli bir kaynak. Bu hücreler, Doğa (5) otoreaktif, ama onlar otoimmünite önlemek için nasıl kontrol edilir hala tam olarak anlaşılmış değildir. Aksine, CD5

Protokol

  1. Işlemine başlamadan önce, aşağıdaki öğeleri toplanmış ve hazırlanmış olması gerekir:
    • Buz
    • 27g iğne ile 5ml şırınga
    • 25g iğne ile 5ml şırınga
    • Strafor blok ve fare montaj pimleri
    • Montaj bloğu yerleştirilmiş olabilir Tepsi
    • Makas ve forseps
    • Toplama tüpleri
    • % 70 etanol
    • PBS ile% 3 fetal buzağı serumu (FCS) (Ön buz üzerinde soğutulmuş ve muhafaza)
  2. Fare Euthanize,% 70 etanol ile sprey ve sırtında strafor blok üzerine monte edin.
  3. Bir makas ve forseps kullanarak periton dış deri kesme ve periton boşluğuna kaplayan iç deri hafifçe ortaya çıkarmak için geri çekin.
  4. 27g bir iğne kullanılarak peritoneal kavite içine buz PBS (% 3 FCS) 5 ml enjekte edilir. Herhangi bir organ dikkatli olmazsanız ponksiyon için periton iğne yavaşça itin.
  5. Enjeksiyondan sonra, periton PBS çözümü herhangi bir bağlı hücreleri çıkarmak için hafifçe masaj yapın.
  6. Periton bir 5 ml şırınga bağlı olarak, 25 g iğne, konik takın ve sıvı yağ dokusu veya diğer organlar tarafından tıkanmasını önlemek için iğne ucu hafifçe hareket ettirerek toplamak. Mümkün olduğunca fazla sıvı olarak toplayın ve şırınga iğnesi çıkardıktan sonra buz üzerinde tutulmalıdır tüplerde toplanan hücre süspansiyonu yatırmak.
    İsteğe Bağlı: Tekrar adım 4-6
  7. Periton iç deride bir kesi yapın ve bir forseps ile cilt tutarken boşluğunda kalan sıvı toplamak için plastik bir Pasteur pipeti kullanın.
  8. 6 ya da 7 adımda görünür kan kontaminasyonu tespit edilirse kontamine örnek atılmalıdır.
  9. 1500 RPM, 8 dakika boyunca toplanan hücre süspansiyonu Spin süpernatantı atmak ve istenen ortam veya PBS içinde hücre sayımı için tekrar süspansiyon haline getirin.

Tiyoglikolat elde Alternatif protokol makrofajlar ortaya çıkardı:

Bu yöntem, makrofajların daha yüksek verim elde etmek için kullanılır.

  1. % 3 (w / v) her fare periton boşluğuna Brewer tiyoglikolat orta (7) 5 ml enjekte edilir.
  2. 3-5 gün bekleyin ve hücrelerin toplanması için yukarıdaki 1. adımı geçin.

Nonelicited yaklaşımı ile karşılaştırıldığında, yaklaşık 10 kat daha fazla makrofaj toplanabilir. Tek endişe, bu yordamı ile elde edilen makrofajlar bazı fizyolojik özellikleri farklı olduğunu.

Temsilcisi sonuçları:

Unmanipulated fare, 5-10 milyon periton boşluğuna hücreleri iyi bir izolasyon protokolü ile elde edilebilir. Tüm canlı hücreler arasında,% 50-60 B hücreleri, ~% 30 makrofajlar ve T hücreleri (Şekil 1)% 5-10.

figure-protocol-1
Şekil 1. Periton boşluğuna izole hücre fenotipi periton boşluğuna hücreleri takiben izolasyonu ile boyandı anti-fare TCRβ FITC, B220-PE-Texas kırmızı, CD11b-Pasifik mavi, CD23-PE-Cy7 ve CD5-APC. Temsilci akış sitometrik araziler, B ve T hücreleri (a), makrofajlar (b), B1 ve B2 hücreleri (c) ve B1a ve B1b hücreleri (d) yüzdeleri göstermektedir.

Tartışma

Periton boşluğuna hücrelerinin izolasyonu, farklı bağışıklık hücreleri, başta makrofajlar ve spesifik B hücre alt çalışma için önemli bir tekniktir. Bu basit bir süreç olmasına rağmen, bazı kritik adımlar vardır. Saf bir periton boşluğuna hücre popülasyonu elde etmek için toplanan örnek kan kirlenmesine varlığı kaçınılmalıdır. Servikal dislokasyon tarafından Ötenazi periton boşluğunda kan kirlenmesini önlemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Alternatif olarak CO 2 kullanılabilir. Buna ek olarak, prosedüre uygun bakım sırasında peritoneal kavite, mesane ya da herhangi bir diğer organlara delinmesiyle önlemek için alınmalıdır. Enjekte edilen sıvı en kurtarma, hücre verimi önemlidir.

Bu prosedürü, yaygın olarak orta numaraları bu yana ikamet eden makrofaj biyoloji okumak için kullanılır, unstimulated makrofajlar kolayca makrofaj koloni stimüle edici faktör (8 kullanılarak, in vitro olgun makrofajlara miyeloid progenitör hücrelerin ayırt zahmetli görev aksine, periton boşluğuna elde edilebilir , 9). Tiyoglikolat kullanımı makrofajlar (7) fizyolojik özelliklerini değiştirebilir olsa da periton boşluğunda makrofaj verim, tiyoglikolat ortaya çıkarma yöntemi kullanarak geliştirilebilir.

B hücreleri bağışıklık sisteminin doğal ve adaptif bağışıklık hem de önemli rol oynayan önemli bir parçasıdır. Farklı B hücre alt arasında, B1 hücreleri B hücreleri doğuştan gelen bağışıklık, otoimmünite ve bağışıklık düzenleme yer eşsiz bir alt oluşmaktadır. B1 hücreler öncelikle periton boşluğunda bulunan ve kendini yeniler. Onlar, ilk satırı, bir virüs sayısı ve bakteriler (10-12) karşı koruma sağlar doğal IgM birincil üreticiler biri. B1 hücreler de immün regülasyon yer alan önemli bir sitokin olan IL-10 (6), önemli bir kaynağıdır. B1 hücreleri ile çeşitli çalışmalar takip olmasına rağmen, hala özel, kendi karşıt fonksiyonları daha fazla değerlendirme için düzenleyici rol kapsamı vardır. Periton boşluğuna hücre izolasyon yöntemi B1 hücrelerinin fonksiyonlarını incelemek için eşsiz bir fırsat sunuyor.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH hibe AI069358 ve BloodCenter Araştırma Vakfı tarafından kısmen desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Tiyoglikolat Besiyeri, Brewer ModifiyeliBD Biosciences211716

Kaynaklar

  1. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Current Protocols in Immunology. , (2008).
  2. Boes, M., Prodeus, A. P., Schmidt, T., Carroll, M. C., Chen, J. A critical role of natural immunoglobulin M in immediate defense against systemic bacterial infection. J. Exp. Med. 188, 2381-2386 (1998).
  3. Mc Daniel, L. S., Benjamin, W. H., Forman, C., Briles, D. E. Blood clearance by anti-phosphocholine antibodies as a mechanism of protection in experimental pneumococcal bacteremia. J. Immunol. 133, 3308-3312 (1984).
  4. Paciorkowski, N., Porte, P., Shultz, L. D., Rajan, T. V. B1 B lymphocytes play a critical role in host protection against lymphatic filarial parasites. J. Exp. Med. 191, 731-736 (2000).
  5. Mercolino, T. J., Arnold, L. W., Hawkins, L. A., Haughton, G. Normal mouse peritoneum contains a large population of Ly-1+ (CD5) B cells that recognize phosphatidyl choline: relationship to cells that secrete hemolytic antibody specific for autologous erythrocytes. J. Exp. Med. 168, 687-698 (1988).
  6. O'Garra, A., Chang, R., Go, N., Hastings, R., Haughton, G., Howard, M. Ly-1 B (B-1) cells are the main source of B cell derived interleukin 10. Eur. J. Immunol. 22, 711-717 (1992).
  7. Hoover, D. L., Nacy, C. A. Macrophage activation to kill Leishmania tropica: Defective intracellular killing of amastigotes by macrophages elicited with sterile inflammatory agents. J. Immunol. 132, 1487-1491 (1984).
  8. Austin, P. E., McCulloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. J. Cell Physiol. 77, 121-134 (1971).
  9. Stanley, E. R. The macrophage colony-stimulating factor, CSF-1. Methods Enzymol. 116, 564-587 (1985).
  10. Baumgarth, N., Chen, J., Herman, O. C., Jager, G. C., Herzenberg, L. A. The role of B-1 and B-2 cells in immune protection from influenza virus infection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 252, 163-169 (2000).
  11. Baumgarth, N., Herman, O. C., Jager, G. C., Brown, L. E., Herzenberg, L. A., Chen, J. B-1 and B-2 cell-derived immunoglobulin M antibodies are nonredundant components of the protective response to influenza virus infection. J. Exp. Med. 192, 271-280 (2000).
  12. Berland, R., Wortis, H. H. Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5. Annu. Rev. Immunol. 20, 253-300 (2002).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

H cre zolasyonuAk SitometrisiHemositometre ile Say mPBS EnjeksiyonuPeritoneal MasajH cre Y kamaSantrif j ProtokolB H cresi Analizi

İlgili makaleler