Method Article

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

DOI:

10.3791/1508

September 8th, 2009

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada izlenir ve sayısal, fonksiyonel moleküler kompleksler tespit sağlamak için canlı bakteri hücreleri tek-molekül floresan mikroskopi gerçekleştirmek için protokolleri göstermektedir.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sadece hücresel düzeyde olayları ortaya çıkarmak ve doğrudan temel süreçleri araştıran, canlı hücrelerin mekanizmalarını içine tam fikir elde edilebilir. Yerine nispeten ham dökme topluluk ortalamanın ölçümler kullanılarak yapılan çalışmalarda tek sistemleri odaklanarak, biyolojik sistemlerin kayma karmaşıklığı Bugüne kadar çok talep olması kesin tek molekül deneyler neden oldu. Ancak, çok önemli süreçler, sadece bir düzeyinde yaşayan hücre ya da birkaç molekül oluşur; topluluk ölçümleri genellikle bu olayların stokastik ve heterojen doğası maske. Burada, gelişmiş optik mikroskop ve analitik görüntü analiz araçları kullanarak, tek bir canlı bakteri tek moleküllerin hassas bir hücre ve biyolojik makineleri işleyen moleküler kompleksler içinde dinamiklerini izleyebilirsiniz içinde proteinler izlemek için nasıl gösterilmektedir. Teknikleri fizyolojik doğrudan ilgili. Minimal pertürbatif ve biyolojik örnek çalışma altında non-invaziv ve yaşam malzemesi araştırmalar için tamamen uydurulmuş, biyofizik diğer tek-molekül yaklaşımlara hazır özellikleri. Buna ek olarak, biyolojik örneklerin hepsi doğal olarak ortaya daha belirgin olarak daha fazla protein üretmek için, daha sık ama daha az ideal bir yaklaşım karşı değiştirilmemiş hücre suşları ("genomik kodlama"), hemen hemen aynı seviyelerde floresan etiketli proteini üretmek okudu ("plazmid ifade"). Böylece, gerçek biyolojik örnekler ele alınacaktır doğal organizmalar için önemli ölçüde yakın ve gerçek fizyolojik süreçleri nedenle gözlemler daha uygun.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bu yordamı başlamak için, Escherichia coli bakteri hücrelerinin ifade floresan protein dondurulmuş stoklarının 50 ul ilk çözülmüş ve C. sabah 37 derece gecede 5 ml LB büyüme ortamı sallayarak aerobik yetiştirilen, bu doymuş kültür 50 ul ayıklanır 4 ila 6 saat boyunca 30 ° C'de inkübe minimal M63 glikoz kültür ortamı, alt-kültür. Burada, biri bir elektron taşıma ifade iki farklı hücre suşları, açıklamak GFP, GFP için erimiş bakteriyel flagellar motor yer alan bir protein ifade diğer erimiş sitokrom.
  2. Hücreler, büyüyen alt-kültür immobilize örnekleri olarak varsa da doğrudan hasat, ya da "gergin" koşullar altında görüntülerken, bakteri kamçısı kesecek makaslanmış ola....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakım bu yana gergin bakteri bakarak "flagellar motorlar üzerine kesme" hücre işlevlerini bozabilir değil alınmalıdır. Oksijen tükenmiş olabilir hücreleri mikroskop lamı üzerine bir kez bir saat daha uzun kullanmak için önemlidir. Önemli bir optimizasyon en iyi mikroskop görüntüleme koşulları soruşturma altında belirli bir biyolojik sistem yiyecek ve içecek bulmak için gerekli olabilir. Özellikle mikroskop sistemi için gerekli olan doğru yoğunluklu lazer uyarma tespit etmek için tek başına saflaştırılmış GFP k.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Prof. Judith Armitage (Oxford Üniversitesi, İngiltere) ve Prof. Conrad Mullineaux (Londra Queen Mary Üniversitesi, UK) grupları bakteri suşlarının tür bağışlar kabul etmiş oluyorsunuz. IMD Biyokimya Bölümü (Oxford Üniversitesi) ve OCISB tarafından ortaklaşa finanse edilen AR Mühendislik ve Fiziksel Bilimler Araştırma Konseyi (EPSRC) DTC öğrencilikle tarafından finanse edilmektedir; ND Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC) finanse edilmektedir; MCL Royal Society Üniversitesi Araştırma Bursu tarafından finanse edilmektedir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Leake, M. C., Chandler, J. H., Wadhams, G. H., Bai, F., Berry, R. M., Armitage, J. P. Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes. Nature. 443, 355-358 (2006).
  2. Leake, M. C., Greene, N. P., Godun, R. M., Granjon, T., Buchanan, G., Chen, S., Berry, R. M., Palmer, T., Berks, B. C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule FluorescenceAdvanced Fluorescence MicroscopyLiving Bacterial CellsFluorescent Protein TaggingTotal Internal Reflection FluorescenceElectron Multiplying CameraHigh Numerical Aperture ObjectiveFluorescent Spot DetectionPhoto Bleaching AnalysisMolecular Complex Visualization

Related Articles