Göz hayali Disk Görselleştirme Yardım Roman RFP Reporter Drosophila</em

Özet

Biz özellikle ifade edilir bir roman kırmızı floresan proteini (RFP) muhabiri tarif Drosophila Göz. Biz, ayrıntılı göz hayali disk diseksiyon için bir metodoloji ve nasıl bu muhabir diseksiyon ve gelişmekte olan göz özel hücre tiplerinin belirlenmesi yardım için kullanılabilir.

Protokol

İlk bir damla.
1. Sonraki spatula kullanarak bir şişe veya şişe birkaç dolaşıp üçüncü instar larvaları kaldırmak ve PBS koyun.
2. Diseksiyonu larva arka yolunda üçte ikisi kavramak ve daha sonra diğer çifti kullanmak için ön sonunda koyu renkli ağız kanca tutmak için (sağ elle) sol elinizle cımbız kullanın başlamak için.
3. Şimdi, yavaşça cımbız hem çiftleri birbirinden uzakta hareket ettirerek larva hariç çekin. Ağız göz / beyin kompleksi bağlı ile vücudun geri kalanından uzak gelmelidir.
4. 30-45 dakika boyunca buz üzerinde% 4 paraformaldehid / PBS çözüm onları koyarak immünofloresan düzeltme bu noktada diskler için göz diskler leke. Sonra PBST ile diskler, dört kez yıkayın ve sonra uygun antikorlar ile leke.
5. Göz diskleri doğrudan bir slayt incelemek kolayıdır. Bir slayt PBS bir damla koyun ve ağız tutarak PBS damla diskleri taşımak.
6. Hayali dokular saydam ve göz diskleri tespit etmek zordur, bu yüzden ilk. Kolay, onları floresan yeteneği ile bir diseksiyon mikroskobu tanımlamak için yapmak. Göz RFP muhabir hattı göz diskler küresel optik loblar (Şekil 1) kaplanacağı kırmızı floresan doku olarak açıkça görülebilir.
7. , Bu diskler, daha fazla kontrast verecek gibi, slayt eğik bir açıyla ışığı doğrudan fiber optik soğuk ışık kaynağı kullanıyorsanız. Göz / antennal diskler arka optik sapı ile optik loblar ve ön antennal disk gelen bir sap aracılığı ile ağız bağlıdırlar.
8. Göz diskler bir çift cımbız kullanarak ağız tutun incelemek ve larva beyin göz diskleri ayrı diğer çifti kullanmak için. Sonraki ağız göz diskleri ayrı. Son slayttan ağız kaldırmak bu düz yalan lamel önleyebilir.
9. Tüm göz diskler slayt hafifçe eğin ve aşırı PBS kapalı kuru disseke zaman. Sonra Vectashield bir damla ekleyin ve bir lamel yavaşça üstüne yerleştirin.
10. Diskler artık ya Epifloresans veya konfokal mikroskobu (Şekil 2) ile görüntülü olmaya hazırız.

Temsilcisi Sonuçlar

Doğru disseke göz / antennal disk, beyinde herhangi bir yabancı doku gibi açık slayt üzerinde düz durmalıdır. Göz disk dorsal ve ventral kutupları kavisli ve böylece kat eğilimindedir, ama bu konfokal mikroskop Z-serisi projeksiyon alma ve bu bölümleri atlayarak önlenebilir. Çekirdekleri değişken pozisyonları disk tek tabakalı epitel olmasına rağmen disk genel bir resim elde etmek için Z-serisi projeksiyon gerektirir. Konfokal mikroskop alınan tipik bir göz RFP göz / antennal disk bir projeksiyon Şekil 2'de gösterilmiştir. Biz genellikle 20x veya 40x lens kullanarak disk üzerinden 1 mikron bölümleri. Göz RFP muhabiri nükleer lokalize ve Şekil 2'de görülen desen RFP ifade hücrelerinin çekirdekleri temsil eder.

Şekil 1. İlk diseksiyon, göz RFP üçüncü instar Drosophila larva göz / beyin kompleksi. Göz / antennal hayali disk (özetlendiği gibi), ağız (MP) ve beynin optik lob (OL) kaplanacağı bağlı görülebilir. Görüntü göz disk RFP ifade göstermek için floresan bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak alınmıştır. Anterior sol. Ölçek çubuğu: 300 mm.

Şekil 2. İfade, göz hayali disk göz RFP muhabiri. RFP ifade (kırmızı) gösteren bir göz RFP larva disseke üçüncü instar göz (ED) / antennal disk (AD). Disk morfogenetik karık (ok ucu) lekeleri apikal hücre yüzeyleri ve Phalloidin (yeşil) ile boyandı. RFP fotoreseptörlerin 1,6,7 ve koni hücreleri, MF çapında öncü hücreler olarak ifade edilir. Anterior sol. Ölçek çubuğu: 25 mm.

Tartışma

Drosophila göz hayali disk Diseksiyon basittir, ama ustalaşmak zaman alabilir. Kritik adımlar göz disk ve larva beyin uzak, diseksiyon belirlenmesi. Burada anlatılan göz RFP hattı kullanarak göz disk tanımlanması daha kolay yapılır. Olası değişiklikler antennal disk veya peripodial membran kaldırmak, ya da beyin giren PR aksonlar görselleştirmek bağlı optik lob bırakmak.

Göz RFP hattı klonlama Pred H-Stinger arttırıcı-muhabiri vektör ³ içine bir roman sivri P2 ge...