Yöntem makalesi

Görselleştirme RNA Yerelleştirme Xenopus Oosit

DOI:

10.3791/1704

⸱

14 Ocak 2010

 , 
1Department of Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Brown University

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Görselleştirme In vivo RNA ulaşım floresan etiketli RNA transkript mikroenjeksiyon yapılır Xenopus Oosit, konfokal mikroskobu ile takip.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA lokalizasyonu hücre polarite kurulması korunmuş bir mekanizma. Vg1 mRNA Xenopus laevis oosit ve mekansal Vg1 protein gen ekspresyonu kısıtlamak için eylemler bitkisel direğe lokalize. Bu şekilde dağılımı Vg1 sıkı kontrol gelişmekte olan embriyonun uygun germ tabakası belirtimi için gereklidir. MRNA 3 'UTR RNA dizisi elemanları, Vg1 yerelleştirme elemanı (VLE) gerekli ve doğrudan ulaşım için yeterli. In vivo Vg1 mRNA tanıma ve taşıma çalışma için, basit bir görsel okuma ile trans-faktör yönelik taşıma mekanizmalarının kapsamlı analizini sağlayan bir görüntüleme tekniği geliştirdiler.

RNA yerelleştirme görselleştirmek için, floresan etiketli VLE RNA sentez ve bireysel oosit bu transkript microinject. Enjekte edilen RNA taşıma izin oosit kültürü sonra oosit konfokal mikroskobu ile görüntüleme için önce sabit ve kurutulmuş. MRNA yerelleştirme desen Görselleştirme RNA ulaşım tam yol izlenmesi ve cis etkili VLE (Lewis ve ark, 2008 bağlamak transkript ve trans-etkili faktörler içinde unsurları, RNA ulaşım yönlendirmede rolleri tanımlamak için bir okunmasını sağlar Messitt ve ark, 2008). Biz ek RNA ve proteinler (Gagnon ve Mowry, 2009, Messitt ve ark, 2008) ile eş-yerelleştirme yoluyla bu tekniği var ve motor protein ve hücre iskeletinin bozulması ile birlikte prob (Messitt ve ark, 2008) mRNA yerelleştirme altında yatan mekanizmalar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bölüm 1: floresan ile işaretlenmiş mRNA Transkripsiyon.

  1. Plazmid DNA, RNA yerelleştirme elemanı ya da ilgili diğer dizisi içeren Linearize ve 1 mcg / ml DEPC tedavi H 2 O. ile tekrar süspansiyon DNA şablonu T7, SP6 veya T3 RNA polimeraz tarafından transkripsiyon için upstream organizatörü sitelerine sahip olması gerekir.
  2. 1.5mL steril bir tüpe aşağıdaki reaktifler ekleyin:
    a. 10X Tx tampon (M & M) 2 ul
    b. 20X kapak / NTP mix (M & M) 1 ul
    c. 1 mM Alexa Fluor 546-14-UTP (Invitrogen) 1 ul
    d. UTP, [α-32 P] (1 μCi / ml) (Pe....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada Xenopus oositleri mRNA yerelleştirme görselleştirmek için bir protokol var. Bu yöntem, floresan etiketli RNA transkript kullanarak önceden digoxigenin etiketli transkript ile elde edilen ve in-situ temelli yaklaşımlar (Mowry Melton, 1992, Gautreau ve ark, 1997) daha basit ve daha hızlı daha yüksek sinyal gürültü oranına sahiptir. Bu yöntemi kullanarak, mühendis dizisi mutasyonlar RNA ve hızlı bir şekilde in vivo fonksiyon testi. Ayrıca, ek Alexa UTP fluorophores kullanarak, birden fazla RNA türl.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Brown Üniversitesi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak laboratuvar hayvanlarında kullanılarak yapılan deneyler yapıldı.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA lokalizasyonuna KLM NIH (R01GM071049) bir hibe ile desteklenmektedir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

10X Tx tampon

  • 60 mM MgCl 2
  • 400 mM Tris-HCl (pH 7.5)
  • 20 mM spermidin-HCl

20x kapak / NTP karışımı

  • 10 mM CTP
  • 10 mM ATP
  • 9 mM UTP
  • 2 mM GTP
  • 20 mM G (ppp) G Cap Analog (New England Biolabs)

G-50 sütun

  • Hidrat 5 ml 100 g Sephadex G-50 boncuk (Sigma Aldrich) H 2 O. deiyonize 30 dakika DEPC davranın. ve otoklav. Eksik stok oda sıcaklığında saklayın. Kullanmadan önce, aşağıdaki RNaz ücretsiz çözümleri ekleyin:
  • 0.5 ml 0.2 M EDTA
  • 1 ml 1 M Tris pH: 8.0
  • 0.5 ml% 20 SDS
  • 4 ° C'de tam G-50 çözüm saklayın
  • Çıkartın ve atın piston 3 ml şırınga (BD Biosciences) ve 15 ml konik tüp (Corning) içine şırınga varil. Cam yünü (bir kuruş yarısı boyutu hakkında bir eklenti) küçük bir miktarı ile şırınga takın.
  • Boncuklar tekrar süspansiyon çalkalanarak tam G-50 çözüm.
  • Boş sütun için 2 ml G-50 çözüm ekleyin.
  • 1 dakika için 1.000 x g benchtop santrifüj Spin.
  • 200 ul DEPC tedavi deiyonize H 2 O, her bir sütun ekleyin. Spin.
  • Üç yıkama olmak üzere toplam iki kez daha tekrarlayın yıkayın.
  • Yeni bir 15 ml konik tüp şırınga varil çıkarın.

Kollajenaz çözüm

  • Clostridium histolyticum (Sigma Aldrich) 75 mg kollajenaz
  • 25 ml 0.1 M KPO 3 + (pH 7.4)

MBSH tampon

  • 88 mM NaCl
  • 1 mM KCl
  • 2.4 mM NaHCO 3
  • 0.82 mM MgSO 4 X 2 O 7H
  • 0.33 mM Ca (NO 3) 2 X 4H 2 O
  • 0.41 mM CaCl 2 X 6H 2 O
  • 10 mM HEPES (pH 7.6)

Oosit Kültür Orta

  • % 50 L15 orta
  • 15 mM HEPES (pH 7.6)
  • 1 mg / ml insülin
  • 100 mg / ml gentamisin
  • 50 U / ml nistatin
  • 50 U / ml penisilin
  • 50 mg / ml streptomisin

MEMFA çözümü

  • 0.1 M MOPS (pH 7.4)
  • 2 mM EGTA
  • 1 mM MgSO 4
  • % 3.7 formaldehit

Bilgisayar RNA verimi

  • "Giriş" ve standart bir sintilasyon sayacı kullanarak "anonim" örneklerini BGBM belirleyin.
  • dahil = ("dahil") / (10 x "giriş")
  • Tipik kuruluş değerleri ~ 0.03 ve 0.10 arasında değişmektedir.
  • Farklı polimerazları için maksimum teorik verir:
    T3, T7, SP6 - 2.64 mg
  • Reaksiyon verimi mg = (maksimum verim polimeraz kullanılır) X (dahil)
  • Sulandırınız RNA 50 nM = (mikrogram RNA) / 320 / (üsleri RNA uzunluğu) / (5x10 -8)
  • Reaksiyon genellikle verimi ~ 50 nM RNA 50-100 ul.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cohen, S., Au, S., Pant, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. JoVE. 24, (2009).
  2. Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis (Daudin). I. Stages of oocyte development in laboratory maintained animals. J. Morphol. 136, 153-179 (1972).
  3. Gag....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Düzeltme

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes
Posted by JoVE Editors on 6/10/2011. Citeable Link.

null

Etiketler

Floresan RNAMikroenjeksiyonKonfokal MikroskopiVg1 mRNAVLE RNAOosit K lt rFiksasyon DehidratasyonMotor Proteinler

İlgili makaleler