Protokol Metilotropik maya kullanarak protein ekspresyonu açıklar. Pichia pastoris. Electrocompetent maya hücrelerinin hazırlanması, ilgi gen içine vektör dönüşümü S. pastoris Ve maya DNA arıtma de yapılmaktadır. Western blot analizi ve protein saflaştırma bu protein ifade protokolünde son adımları oluşturmak.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Rekombinant Proteinlerin Metilotropik maya İfade Pichia pastoris
Bu makalede
Özet
Özet
Mikrobiyal ökaryotik konak Pichia pastoris protein ekspresyonu, hızlı ve kullanımı kolay bir ifade sisteminde yüksek miktarda rekombinant protein üretme imkanı sunmaktadır .
Tek hücreli bir mikroorganizma P. gibi pastoris işlemek için kolay ve ucuz medya yüksek hücre yoğunluğu hızla büyüyor. Ökaryot, P. olmak pastoris yüksek ökaryotik hücrelerde ve elde edilen rekombinant proteinler tarafından gerçekleştirilen post-translasyonel modifikasyonlar birçok protein katlanması, proteolitik işleme, disülfit bağı oluşumu ve glikozilasyon [1] tabi gerçekleştirmek için yapabiliyor.
Metilotropik maya P. olarak pastoris tek karbon kaynağı olarak metanol metabolize yeteneğine sahiptir. Alkol oksidaz, AOX1, güçlü organizatörü, sıkı bir şekilde düzenlenir ve metanol ile indüklenen ve ilgi gen ifadesi için kullanılır . Buna göre, yabancı protein ifade besi metanol ekleyerek indüklenen olabilir [2, 3].
Diğer önemli bir avantajı, bir sinyal dizisi kullanarak P. pastoris sekretuar yolu yabancı bir proteini hedef, büyüme ortamına rekombinant protein salgılanmasını. Heterolog protein, medya maya kendisi tarafından salgılanan endojen protein ve medya için hiçbir katma proteinler sadece düşük seviyeleri ile total protein, orta ve büyük çoğunluğu oluşturur ve protein saflaştırılması adımları izleyerek kolaylaştırmaktadır [3, 4].
Rekombinant protein, E. her iki seçim için bir Zeocin direnç geninin salgılanması için α-faktörü salgılanması sinyali Burada kullanılan vektör (pPICZαA) faiz gen sıkı bir şekilde düzenlenir, metanol indüklenen ifade AOX1 organizatörü içeren coli ve Pichia ve c-myc epitopu ve rekombinant protein algılama ve saflaştırılması için polyhistidine (6xHis) etiketi içeren bir C-terminal peptid. Ayrıca, ana vektörü, c-myc epitop tanıma Anti-myc-HRP antikor kullanarak rekombinant protein batı blot analizi göstermektedir .
Protokol
Metilotropik maya Pichia pastoris rekombinant proteinlerin İfade
Bu protokol başlamadan önce bir P. çerçeve klonlanmış ilgi geni olmalıdır doğru yerleştirilmesi için vektör ilgi gen kontrol etmek için pastoris ebeveyn vektör ve sıralı var.
Adım: P. içine yapı ve dönüşüm doğrusallaştırma electrocompetent maya hücreleri pastoris
Bu adım için, elinizin altında şu medya ve plakalar olması gerekir:
- YPDS plakalar
- 600 mL YPD orta
- steril su buz gibi
- Sorbitol 1 m
- Amicon Ultra-4 Santrifüj Filtre Cih....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Protein ifade Metilotropik maya Pichia pastoris bir ana sistem olarak kullanarak, bu protokolde açıklanmıştır . Protein kullanılan klonlama vektörü bağlı olarak ortama salınır. Rekombinant proteinin salgılanmasını sonraki arıtma kolaylaştırır. Ancak, gösterilen koşullar artan protein düzeyleri neden olabilir farklı proteinler ve koşulları ve ifade kez değişiklikleri ifade için optimize gerekebilir. Bu protokolde kullanılan vektör, c-myc epitop ve bu epitop satın alınabilir bir antikor özelliğine sahipt.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Teşekkürler
Biz bu işi desteklemek için Kanada Vakfı Yenilik, British Columbia Bilgi Kalkınma Fonu ve Kanada Sağlık Araştırmaları (CIHR) Enstitüleri için teşekkür etmek istiyorum. MT Mikrobiyal Çeşitlilik ve Evrim (CMDE) TULA vakıf tarafından finanse edilen Merkezi bir burs ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Kaynaklar
- Cereghino, G. P., Cregg, J. M. Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis. Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).
- Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. Pichia pastoris as a Host System for Transformations. Mol. Cell.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
