Organizatör ve Hayvan Kutbu eksplantlar Xenopus laevis Embriyolar ve Hücre Yapışma Testi Meclisi diseksiyonu

Özet

Kişinin kaş yapılan özel bir diseksiyon aracı - Bu video kaş bıçak kullanımı da dahil olmak üzere Xenopus laevis embriyolar, ajanda ve hayvan kutup eksplantlar hazırlanması için kullanılan tekniği göstermektedir. Yapışma tahlil montaj için protokol de önemli adezyon moleküllerinin varlığı için problar yüzey düzenleyen veya uygun şekilde gelişimi için kritik olan hayvan kutup hücreleri mevcut verilir.

Protokol

Yapışma Odaları hazırlanması (bir gün önce enjeksiyon / diseksiyonu)

Yapışma Testi Odaları

Geleneksel bir bileşik mikroskobu (sahne üzerinde optik bulur) varsa, bu düşük bir yükseklikte yapışma odasına aşağıdaki gibi yapmak için ncecessary. Eğer ters-optik mikroskop kullanılarak, daha sonra "Nunc Lab-Tek odacıklı Coverglass" sadece kullanılan ve adımları atlayın # 1 - 2.

1. 40 x 24mm kapak astar üzerine "basın-mühür silikon izolatör" takın. Temiz masa üstü kapak kayma sıkıca yalıtkan basın ve yalıtkan herhangi bir hava kabarcıkları olmadan tamamen takılı olduğundan emin olun diğer taraftan bakın.
   
   
2. İsteğe Bağlı: yapışma odalarına kuru döngüsü Whatman filtre kağıdı ve otoklav ile sterilize etmek için cam Petri kabı koyun. RT serinleyin.

Kaplama Odası

1. 200ml otoklavlanmış bir yapışma odasının merkezi üzerine kaderin (10mg/ml) veya fibronektin (20mg/ml) çözüm çalışma sigmacoated sarı ipuçlarını kullanarak, bir damlacık koyun. 4 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
   
   
2. Kaderin veya fibronektin çözüm dışarı atın ve bir 1.5ml tüp transfer. Bu çözüm, önümüzdeki iki hafta için yeniden kullanılabilir.
   
   
3. Odanın engellemek için% 4 BSA MBS-H 1x 500ml koyun. 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
   
   
4. BSA çözüm aspire. 1x MBS-H 500ml odasına iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra, MBS-H (tamamen değil) en aspirat ve 4 º C'de kapalı bir kapta saklayın Bu yapışma odasının sonraki 2 - 3 gün iyidir.

Hayvan kap eksplant Diseksiyon ve ayrılma

1. Otoklavlanmış 1x MBS-H seyreltilmiş non-otoklavlanmış orta ayrışmış hayvan kap hücreleri rahatsız bazen küçük mikroplar taşır gibi, 0.1x MBS-H enjekte edilen embriyolar, inkübe edin.
   
   
2. 60mm yemekleri örneklerin sayısı olarak en azından çok, 1x Barth agaroz plakaları ve CMF-MBS agaroz plakaları olun. 1x Barth plakaları otoklavlanmış 1x MBS-H dökün. CMF-MBS plakalar için, CMF-MBS 10ml dökün.
   
   
3. Embriyoların aşamada 8.5, 1x Barth plaka hayvan kapakları diseksiyon başlar. 10 - numuneler ortalama 15 eksplantlar bir deney için genellikle yeterlidir.
   
   
4. CMF-MBS plaka hayvan kap eksplantlar aktarın. 45 - 60 dakika için eksplantlar eksplantlar tamamen ayrışmış kadar inkübe edin. Nazik ajitasyon her 15 dakikada bir ayrışma yardımcı olacaktır.

Hücre Yapışma Testi

1. Hücrelerin Yayımlamak: 1x MBS-H 500ml Yukarıdaki bölümlerde, Yapışma Testi Odalar ve Kaplama Odası adımları hazırlanan yapışma odasına koyun. CMF-MBS plaka sigmacoated ve doğranmış-off sarı ipuçları P200 kullanarak yapışma odasına ayrışmış hayvan kap hücreleri aktarın.
   
   
2. İsteğe bağlı: Mümkünse, dikkatle, havaya hücreleri maruz kalmadan, yaklaşık 2 / 3 yarım orta kadar emmek. Yaklaşık olarak aynı ortamda yeterli Ca ² içerdiğinden emin olun miktarda taze MBS-H ⁺ ve Mg ^{2 +.}
   
   
3. 45 - 90 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Alt yüzeyinde bağlama olup olmadığını görmek için zaman zaman hücrelerin kontrol edin.
   
   
4. Şimdi hücrelerin mikroskop altında resim alabilir.
   
   
5. Izgara slayt camına yapışma odasına koyun. Yapışma odanın köşelerinden biri ızgara slayt bir köşesine hizalayın. Sayın ve birkaç farklı ızgaraları ekli hücrelerinin sayısını kaydedin.
   
   
6. Büyük bir plastik kova (örneğin, Tupperware, vb.) MBS-H 1L dökün. Yapışma slayt odasına yavaşça kovanın dibine koydu. Az beş dakika boyunca düşük devirli (50) - 60rpm orbital çalkalayıcı döndürün.
   
   
7. Bu bölümde, Hücre Yapışma Testi # 5 adım olarak yapıldı odasının aynı köşede, aynı grid slayt köşesine hizalayarak ızgara slayt geri yapışma odasına koyun. Yıkamadan önce sayılır olduğunu, aynı şebekeye bağlı kalır hücrelerinin sayısını. Yıkamadan sonra bağlı kalır hücrelerinin yüzdesini hesaplayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1x MBS-H	Tampon			Modifiye Barth’s besiyeri: 1 L reçete: 5,14 g NaCl 5 mg KCl 0,2 g NaHCO3 0,2 g MgSO4•7H2O 60 mg CaCl2•2H2O 80 mg Ca(NO3)2•4H2O2. 38 g HEPES, serbest asit. pH'ı NaOH ile 7,4'e ayarlayın. Otoklavlayın.
CMF-MBS	Tampon			Bu, MBS-H'nin Ca2+/Mg2+-içermeyen versiyonudur. 500 mL reçete: 2,57 g NaCl 37,5 mg KCl 0,1 g NaHCO3/sub> 1,19 g HEPES, serbest asit. pH'ı NaOH ile 7,4'e ayarlayın. Otoklavlayın.
%1 agaroz/1x Barth’s plakları				örnek sayısı kadar
%1 agaroz/CMF-MBS plakları				örnek sayısı kadar
E-Kaderin/Fc kimera	Reaktif	Sigma-Aldrich	E-2278	100x ana stok (1,0 mg/ml) hazırlamak için 0,1 mg katı E-kaderini, %40 gliserol içeren 100 µL 1x MBS-H içinde çözün. –20 °C'de saklayın. Kullanmadan hemen önce 10 µg/ml çalışma çözeltisi hazırlamak için 1x MBS-H ile 1/100 dilüsyon yapın. Örnek başına 200 µL bu çalışma çözeltisine ihtiyacınız vardır.
Fibronektin, %0,1 çözelti	Reaktif	Sigma-Aldrich	F-1141	Bu önceden hazırlanmış çözelti 50x stok olarak kullanılabilir. Kullanmadan hemen önce 20 μg/mL çalışma çözeltisi hazırlamak için 1x MBS-H ile 1/50 dilüsyon yapın. Örnek başına 200 μL bu çalışma çözeltisine ihtiyacınız vardır. Katı Fibronektin kullanımını önermiyorum, çünkü stok çözeltiyi hazırlamak için %0,1 konsantrasyonda çözmek zordur. Daha pahalı olmasına rağmen, tutarlı sonuçlar elde etmek için bu önceden hazırlanmış %0,1'lik çözelti daha iyidir.
%4 BSA /MBS-H	Tampon			BSA: moleküler biyoloji sınıfı fraksiyon V
Sigmacoted sarı uçlar	Araç
No.1 lameller				40 mm x 24 mm veya 60 mm x 24 mm
Bas-mühürle silikon izolatör	Araç	Glace Bio-Labs	JTR20-2.5	2,5 mm derinlik x 20 mm çap
NUNC Lab-Tek Kameralı Lam	Araç	Fisher Scientific	12-565-471	2 kuyucuk/lam
Izgaralı lam camı	Araç			veya hücre sayımı için Finder gratikülü