Kinesin Powered Moleküler minibüsleri üzerine Kargo Yükleniyor

Özet

Fonksiyonlu mikrotübül üzerinde kayma yüzeyi yapıştırılır kinesin motorlu proteinlerinin nano ölçekli bir taşıma sistemi olarak hizmet verebilir oluşan Moleküler mekik. Burada, tipik bir servis sistemi montaj açıklanmıştır.

Özet

Hücreler kinesin motor proteinlerin ve mikrotübül filamentler gibi aktif hücre içi kargo taşımacılığı desteklemek için, gelişmiş moleküler makineler gelişmiştir. Kinesins kuyruk etki alanı yüklerin çeşitli bağlar iken, kinesins baş etki alanı mikrotübül kafes boyunca adım ATP molekülleri depolanan kimyasal enerjiyi kullanır. Uzun, sert mikrotübül, uzun mesafe hücre içi ulaşım için parça olarak hizmet vermektedir.

Bu motorlar ve filamentler, aynı zamanda ^moleküler mekik 1 bileşenleri olarak microfabricated sentetik ortamlarda istihdam edilebilir. Sık kullanılan bir tasarım, kinesin motorlar kendi kuyrukları ile parça yüzey demirlemiş ve Fonksiyonlu mikrotübüllerin bu motorlar ile hareketli yük taşıyan unsurları, olarak hizmet vermektedir. Bu mekik, biotin ve streptavidin arasında güçlü ve seçici bir bağlayıcılığı kullanan kargo ile yüklenebilir. Anahtar bileşenleri (biotinlenmiş tubulin, streptavidin ve biotinlenmiş kargo) ticari olarak kullanılabilir.

Klasik ters motilite tayini ² Bina, inşaat moleküler mekiklerinin burada ayrıntılı. Kinesin Motor proteinleri kazein ile kaplanmış bir yüzeye adsorbe; mikrotübül, biotinlenmiş tubulin polimerize kinesin yapıştırılır ve daha sonra rodamin etiketli streptavidin ile kaplı. ATP konsantrasyonu kargo ³ yükleme için optimum bir mikrotübül kayma hızı elde etmek için subsaturating konsantrasyon tutulur. Son olarak, biotinlenmiş floresein etiketli nanokürecikler kargo olarak eklenir. Nanokürecikler kayma yüzeyine yapışan mikrotübül ve nanokürecikler arasındaki çarpışmalar sonucu olarak mikrotübül eklemek.

Protokol biotinlenmiş DNA ^4, kuantum noktaları ⁵ veya biotinlenmiş antikorlar ^4-6 aracılığıyla antijenleri geniş bir yelpazede çeşitli yüklerin kolayca yüklemek için modifiye edilebilir.

Protokol

1) Tamponlar ve Reaktifler

Bu çözümler, önceden hazırlanmış ve uygun büyüklükteki alikotları saklanmalıdır. Bir kısım tipik bir deney ve taze bir kısım her motilite tayini için kullanılması gereken yeterli bir çözüm bulunmalıdır. Saklama koşulları ve tipik kısım boyutları da aşağıdaki protokollerden söz edilmektedir.

1. BRB80 tampon, (80 mM BORU, 1 mM MgCl _2, 1 mM EGTA deiyonize distile (dd) su, KOH ile 6.9 pH değeri ayarlanmış)

• Gg su EGTA 0.5 M 100 mL stok çözelti olun. 2 M NaOH çözeltisi ile 7.0 pH ayarlayın.
• 1 M MgCl ₂ gg su 100 mL stok çözelti olun. Çözüm Otoklav.
• 24,2 g BORU ve gg su yaklaşık 800 ml, 3,1 g KOH pelet ekleyin ve erimesi için karıştırın. 1 M KOH çözeltisi kullanılarak 6.9 pH ayarlayın. 0.5 M EGTA stok solüsyonu ve 1 mL 1 M MgCl ₂ stok solüsyonu 2 ml ekleyin. Gg su ile hacmi 1000 ml 'ye kadar getirin.
• Ileride kullanmak üzere -20 ° C'de 50 ml şahin tüpleri ve dondurma haline kısım. BRB80 tüp şu anda kullanılmakta olan 4 ° C ya da oda sıcaklığında saklanabilir.

2. Magnezyum Klorür, MgCl ₂ (100 mM gg su)

• 100 mM son bir konsantrasyon elde etmek için gg su sulandırınız.
• Ileride kullanmak üzere -20 ° C'de 0.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve mağaza içine kısım (10 mcL hacmi)

3. Guanozin-5'-trifosfat, disodyum tuzu, GTP (25 mM NaOH tarafından 7 ayarlanabilir gg su, pH)

• Tartılır ve gg suda çözülür ve 2 M NaOH çözeltisi ile pH ayarlamak 7.
• 260 nm dalga boyunda UV absorbans ölçerek konsantrasyon olun. (11.7 x 103 M ^-1 cm ^-1 bir sönüm katsayısı kullanın).
• 0.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de muhafaza içine kısım (10 mcL hacim).

4. Dimetil sülfoksit, DMSO

• 0.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de muhafaza içine kısım (10 mcL hacim).

5. Taxol (DMSO 1 mM)

• Tartılır ve 1 mM son bir konsantrasyon elde etmek için davlumbaz altında DMSO içinde çözülür.
• 0.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de muhafaza içine kısım (20 mcL hacim).

6. D-(+)-Glikoz (gg su 2 M)

• Tartılır ve 2 M. nihai bir konsantrasyon elde etmek için gg su içinde çözülür
• 0.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de muhafaza içine kısım (20 mcL hacim).

7. Glikoz Oksidaz, (BRB80 içinde 2 mg / ml)

• 2 mg / ml son bir konsantrasyon elde etmek için BRB80 içinde eritin.
• 0.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de muhafaza içine kısım (20 mcL hacim).

8. Dithiothreitol, DTT (1 M gg su)

• 1 M. nihai bir konsantrasyon elde etmek için, davlumbaz altında gg suda çözülür
• 0.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de muhafaza içine kısım (20 mcL hacim).

9 - Katalaz, (BRB80 içinde 0.8 mg / ml)

• 0.8 mg / ml son bir konsantrasyon elde etmek için en az 2 kademeli BRB80 içinde eritin. UV absorbansı 276 nm ve 406 nm (276 nm de 3.1 x 10 ⁵ M ^-1 cm ^-1 ve 2.2 x ⁵ 10 M 406 nm'de ^-1 cm ^-1 bir sönüm katsayısı kullanın ölçerek her aşamada konsantrasyonunu belirlemek ve denklemi A = cL).
• 0.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de muhafaza içine kısım (20 mcL hacim).

10 Adenozin-5'-trifosfat, ATP (100 mM MgCl ₂ 100 mM)

• Gg su içinde 100 mM MgCl ₂ stok solüsyonu hazırlayın. Kuru toz tartılır ve 100 mM son bir konsantrasyon elde etmek için bu stok solüsyonu çözülür.
• 260 nm dalga boyunda UV absorbans ölçerek konsantrasyon olun. (15,4 x 10 ³ M ^-1 cm ^-1 bir sönüm katsayısı kullanın).
• 0.5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve gelecekte kullanılmak üzere -20 ° C'de muhafaza içine kısım (20 mcL hacim).

11. Kazein çözeltisi (20 mg / ml kazein BRB80 içinde)

• Yaklaşık 3 g kazein, 30 ml, 50 ml şahin tüp dd su ekleyin. Vorteks çözüm yaklaşık 1 saat kadar kalın tutarlılık geliştirir.
• 30 dakika boyunca yaklaşık 15000 gr santrifüjleyin. Filtre 0.5 mikron ve 0.2 mikron şırınga filtreler aracılığıyla süpernatantı.
• UV absorbansı 280 nm (0.67 mL mg ^-1 cm ^-1 bir sönüm katsayısı kullanın) ölçerek süpernatantı konsantrasyonu belirleyin. 20 mg / ml BRB80 seyreltilir.
• Kısım (20 mcL hacmi)0.5 mL mikrosantrifüj tüpler ve ileride kullanmak üzere -20 ° C'de saklayın.

2) Standart Çözümleri

Bu deney gün hazırlanır ve deney bittikten sonra atılmalıdır. Her 1 mL hazırlayın.

1. BRB80CS0.5

• BRB80, buz üzerinde 0.5 mg / ml ve mağaza nihai bir konsantrasyonu kazein çözüm seyreltilir. Bu çözüm, önce kinesin akış hücresi içine giriliyor ve yüzey adsorpsiyon sonra kinesin aktivite tutmak yardımcı olur.

2. BRB80CA

• 0.2 mg / ml kazein ve 1 mM ATP BRB80 ve buz üzerinde mağaza hazırlayın. Kinesin daha önce bu çözüm akış hücresi içine giriş kullanarak seyreltilir.

3. BRB80T

• BRB80 oda sıcaklığında 10 mcM ve mağaza nihai konsantrasyonu taksol çözüm sulandırınız. Bu çözüm, mikrotübül stabilize etmek için kullanılır.

4. BRB80CT

• 10 mcM taksol ve BRB80 0.2 mg / ml kazein ve oda sıcaklığında saklayın hazırlayın. Bu da antifade ve mikrotübül çözümler hazırlamak için kullanılır.

5. BRB80AF

• 20 mM D-glukoz, 20 mikrogram / ml glukoz oksidaz, katalaz 8 mcg / mL, 10 mM DTT ve BRB80CT 20 mcM ATP ve oda sıcaklığında saklayın hazırlayın. Bu çözüm streptavidin ve nanokürecikler sulandırmak için kullanılan ve akış hücresi aşırı streptavidin "yıkama". Kinesin hızı bu çözüm ATP konsantrasyonu ayarlayarak kontrol edilebilir.

3.) kinesin Hazırlık

• Express kinesin yabani tip, tam uzunlukta Drosophila melanogaster kinesin ağır zincir ve C-terminal Onun Escherichia coli-tag oluşan inşa ve ⁶ açıklandığı gibi bir Ni-NTA sütun kullanarak arındırmak.
• -80 0,5 mL mikrosantrifüj tüpleri ve mağaza alikotları (10 mcL her) ° C ileride kullanmak üzere. Bu alikotları aktif kinesin konsantrasyonu yaklaşık 200 nM. ⁷
• Tipik bir deneme için, kinesin çözüm BRB80CA 20 kat sulandırmak. Buz üzerinde çözüm KIN20 ve mağaza etiketleyin.

4.) Mikrotubul Hazırlık

• 0,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüp, 25 mcL büyüme çözüm hazırlamak: 4 mM MgCl _2, 1 mM GTP ve% 5 DMSO (v / v) BRB80 tampon.
• 20 mg liyofilize biotinlenmiş tubulin bir kısım için bu çözüm 6.25 mcL ekleyin.
• 37 ısı banyo Vortex, sonra yerde ° C ila 30 dakika polimerize. Yavaşça BRB80T ve vorteks 100 kat sulandırınız. Oda sıcaklığında çözüm MT100 ve mağaza etiketleyin.
• BRB80AF MT100, 10 kat seyreltme olun. Çözüm MT1000 Etiket.

5) Streptavidin ve Nanokürecikli Çözüm

BRB80AF 100 nM bir konsantrasyon AlexaFluor568-etiketli streptavidin hazırlayın. Buz üzerinde STV100 ve mağaza etiket. Aynı şekilde, BRB80AF çözüm nanokürecikler 5000 kat sulandırmak. Buz üzerinde NS5000 ve mağaza Etiket.

6.) Akış Hücre İnşaat

Çift taraflı bant ile ayrılmış iki cam lamelleri kullanarak flowcell oluşturun. Bu akış hücresi, yaklaşık 2 cm uzunluğunda 1 cm genişliğinde ve 100 mm yüksekliğinde ve yaklaşık 20 mcL bir hacmi vardır. Çözümleri filtre kağıdı kullanarak diğer bir pipet ve kötülerin dışarı kullanarak, bir taraftan akış hücresi içine tanıtıldı.

7) Ters Testi Meclisi

Cam yüzey ilk kinesin adsorpsiyon üzerine, onun işlevselliğini korumak sağlar kazein ile kaplanmıştır. Kinesin adsorbe sonra, mikrotübül kinesin tarafından tutuldukları tanıtıldı. Mikrotübüller sonra floresan streptavidin ile kaplıdır. Aşırı streptavidin yıkadıktan sonra, biotinlenmiş polistiren floresein nanokürecikler (40 nm çapında) tanıtıldı. Yüzey adsorbe sabit nanokürecikler hareketli mikrotübül ile çarpışır ve onları (Şekil 1) yüklenir.

Sonraki çözüm getirilmesi önce izin çözümler ve zaman akış sırasına göre aşağıda listelenmiştir.

• BRB80CS0.5, 5 dakika
• KIN20, 5 dakika
• MT1000, 5 dakika
• STV100, 5 dakika
• BRB80AF, 3x
• NS5000

8) Mikroskopi

Nanokürecikli giriş hemen sonra mikroskop sahnede akış hücresi monte edin. Bu deneyde, bir 100X petrol hedefi (NA 1.45), bir X-cite 120 lambası (EXFO, Ontario, Kanada) ve bir IXON EMCCD kamera (ANDOR, Eclipse TE2000-U floresan mikroskop (Nikon, Melville, NY) ile donatılmış South Windsor, CT) kullanılmıştır. FITC filtresi küp (# 48001) ve TRITC filtre küp (# 48002, Chroma Teknolojileri, Rockingham, VT), görüntü nanokürecikler ve mikrotübül respecti için kullanılır.vely alt yüzey akış hücreleri. Maruz kalma arasındaki süre 2 sn iken maruz kalma süresi, 0.2s

Şekil 1. Moleküler mekik şematik çizim.

Tartışma

Küçük değişiklikler ile bu protokolü kinesin-mikrotübül tabanlı motilite testleri başarıyla monte etmek için çeşitli gruplar tarafından kullanılan olmuştur. Son motilite çözüm 10 mM DTT,% 0.5 'β-mercaptoethanol ile değiştirilebilir. 2 saatten fazla standart çözümler (BRB80AF KIN20 ve MT1000) olmamalıdır. Taksol ve özellikle mikrotübül içeren herhangi bir çözüm, buz üzerinde atÛlmamalÛdÛr. Işlevsel bileşenleri fotohasar UV uyarma ışık akışını hücrenin aşırı maruz kalma: mikrotübül ve kinesin akış hücresi gibi polistr...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Adenozin-5’-trifosfat (ATP)	Invitrogen	A1049
Biyotinli tubulin	Cytoskeleton, Inc.	T333
Kazein	Sigma-Aldrich	C-0376
Katalaz	Sigma-Aldrich	C-9322
D-(+)-Glukoz	Sigma-Aldrich	G-7528
Dimetilsülfoksit (DMSO)	Sigma-Aldrich	D-8779
Ditiyotreitol (DTT)	Bio-Rad	161-0610
Etilen glikol-bis(2-amino–etileter)-N,N,N′,N′-tetraasetik asit (EGTA)	Sigma-Aldrich	E-4378
FluoSpheres Biyotinlenmiş mikroküreler, 40 nm, sarı-yeşil floresan (505/515)	Invitrogen	F-8766
Glukoz oksidaz	Sigma-Aldrich	G-7016
Guanozin-5’-trifosfat (GTP)	Roche Group	106399
Magnezyum Klorür (MgCl2)	Sigma-Aldrich	63069
Paklitaksel (Taxol)	Sigma-Aldrich	T1912
1,4-Piperazindietansülfonik asit, Piperazin-1,4-bis(2-etansülfonik asit), Piperazin-N,N′-bis(2-etansülfonik asit) (PIPES)	Sigma-Aldrich	P-6757
Potasyum hidroksit (KOH)	Sigma-Aldrich	P-6310
Sodyum hidroksit (NaOH)	Sigma-Aldrich	480878
Streptavidin Alexa Fluor 568 konjugatı	Invitrogen	S11226