Hücre Hatlarından Küresel Üretim: Üç Boyutlu (3D) Bir Hücre Kültürü Yöntemi

Özet

Kaynak: Dillard, P., et al. CAR T Hücreleri ile Küresel Öldürme Testi. J. Vis. Uzm. (2018).

Spheroids, 2B hücre kültürü tek katmanlı modellere kıyasla bir hücrenin ortamını daha doğru bir şekilde temsil etmek için kullanılan bir tür 3B hücre kültürü modelidir. Örnek protokolde, bilim adamlarının bir kolorektal kanser hücre hattından sferoidler ürettiğini ve sferoidlerin büyümesini izlemek için canlı hücre görüntüleme uyguladığını göreceğiz.

Protokol

1. Kolorektal Kanser Hücre Hattından Sferoid Üretimi

1. HCT 116'yı (Farklılaşma Kümesi 19 (CD19) ve Yeşil Floresan Proteini (GFP)) hücre tek katmanlarını fosfat tamponlu salin (PBS; 25 cm2 için 5 mL veya 75^cm2 şişe için 10 mL) ile yıkayın. Tripsin ekleyin (25^cm2 için 0.5 mL veya 75^cm2 şişe için 1 mL) ve hücreleri 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
2. Mikroskop altında hücre ayrılmasını kontrol edin ve hücre ayrışma enzimini tam Roswell Park Memorial Institute 160 ortamı (RPMI 1640) ile nötralize edin (RPMI 1640 +% 10 FCS + Gentamisin; 25 cm² için 10 mL veya 75 cm² şişe için 20 mL).
3. Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak süpernatanı çıkarın ve 5 mL tam RPM1 1640 ortamı ile birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin.
4. Uyumlu bir hücre sayacında Tripan mavisi dışlamasını kullanarak hücreleri sayın.
5. Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak süpernatanı çıkarın ve 5 x 10³hücre / mL elde etmek için RPMI ortamında yeniden süspanse edin.
6. 96 oyuklu yuvarlak bir alt plakayı, oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS'de 100 μL / kuyu 100 μg / mL poli-L-lizin (PLL) ile kaplayın. PBS ile iki kez yıkayın ve plakayı kurumaya bırakın.
7. Hücre süspansiyonunu steril bir rezervuara aktarın ve çok kanallı bir pipet kullanarak PLL kaplı 96 oyuklu yuvarlak tabanlı plakalara 200 μL/kuyu dağıtın.
8. Plakayı bir inkübatör içindeki otomatik görüntüleme cihazına aktarın (37 °C, %5 CO₂, %95 nem).
9. Edinme yazılımına giriş yapın, Edinme Programını seçin | Başlat Gemi Ekle | Programa Göre Tara | Gemi Oluştur: Yeni.
10. Tarama Türünü Seçin: Sferoid. İlgilendiğiniz kanalları seçin: Faz + Brightfield (sferoidlerin büyümesini takip etmek için), Yeşil (tümör sinyalini takip etmek için, alım süresi 300 ms) ve Kırmızı (apoptozu takip etmek için, alım süresi 400 ms).
    1. İstediğiniz büyütmeyi seçin: 10x.
    2. Plaka modelini ve çekmecedeki konumunu seçin. Görüntülenecek kuyuların konumunu seçin. Deneyin açıklamasını girin: ad, hücre türü, hücre sayısı.
11. Analiz kurulumu için Analizi Daha Sonraya Ertele'yi seçin. Zaman çizelgesine sağ tıklayın ve Seçilen Tarama Grubu Aralığını Ayarlaseçeneğini seçin ve Her seferinde tarama ekle'yi 4 saate ve Toplam 24 saate ayarlayın. İstenen başlangıç zamanını ayarlayın (otomatik görüntüleme cihazında inkübasyondan en az 1 saat sonra).
12. Görüntüleme yazılımına giriş yaparak sferoidlerin büyümesini her 2 günde bir kontrol edin.
    1. Son Taramaları Görüntüle seçeneğini seçin ve istediğiniz deneye çift tıklayın. Görüntü kanalları panelinde Parlak Alan'ı seçin ve ardından sferoidlerin çapını ölçmek için Görüntü özelliklerini ölçme aracını kullanın. Bir sferoidin istenen boyuta ulaşması 6 gün sürer: 0,5 mm çap. Orta buharlaşma etkisini sınırlamak için 4. günde kuyu başına 50 μL tam RPMI ortamı ekleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu	SIGMA-ALDRICH	D8537-500ML	Lot Numarası: RNBG7037
75 cm² büyüme alanı şişeleri	VWR (VWR)	430639	Lot Numarası: 2218002
75 cm² büyüme alanı şişeleri	VWR (VWR)	734-2705	Lot Numarası: 3718006
Tripsin-EDTA	SIGM-ALDRICH	T3924-100ml	Lot Numarası: SLBTO777
RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL	Yaşam Teknolojisi (Gibco)	21875-091	Lot Numarası: 1926384
Gentamicin	Termo Fischer	15750060	Lot numarası: 1904924A
Tripan Mavisi Çözümü, %0,4	Termo Fischer	15250061	Lot Numarası: 1886513
96 kuyulu plaka, yuvarlak alt	VWR (VWR)	734-1797	Lot Numarası: 33117036
X-VIVO 15, Gentamisin L-Gln ile, Fenol Kırmızısı, 1 L	BiyoNordika	BE02-060Q	Lot Numarası: 8MB036
Reaktif Rezervuarı	VWR (VWR)	89094-672	Lot numarası: 89094-672
15 mL tüpler	VWR (VWR)	734-1867	Lot Numarası: 19317044
Fetal Sığır Serumu	Gibco (Gibco)	10500064	Lot Numarası: 08Q3066K
HCT 116 Kolorektal Karsinom Hattı	ATCC (Uzay Servisi)	CCL-247	-
Incucyte S3	Essen Biyobilim