Bu protokol, Zhao ve ark. Yetişkin Zebra Balığı için In Vivo Yüzey Elektrokardiyografisi, J. Vis. Uzm.(2019).
Bu çalışmadaki tüm deneyler, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yapılmıştır. Bu çalışmadaki tüm hayvan protokolleri UCLA Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Anestezi indüksiyonu
- EKG veri toplama sırasında hareket artefaktlarını önlemek için ağrı kontrolü ve balık immobilizasyonu için daldırma anestezisi hazırlayın. Çoğu laboratuvar daldırma trikserin (etil 3-aminobenzoat metansülfonat, MS-222) kullanır.
- Trikadam% 0.4 stok çözeltisini yapmak için, aşağıdaki öğeleri vidalı kapaklı koyu cam bir şişede birleştirin: 400 mg trikin tozu, 98 mL çift damıtılmış su ve 2 mL 1 M Tris (pH 9). Gerektiği gibi 1 N NaOH veya 1 N HCl kullanarak pH 7.0'a ayarlayın.
- Tricaine son daldırma çözeltisini yapmak için, zebra balığı yaşı, boyutu, metabolik durumu, türü, hastalık modeli, bilimsel hedefleri ve prosedür süresi için uygun olan minimum konsantrasyonu belirleyin.
- Mümkün olan en az kardiyorespiratuar toksisite ile 3 dakika içinde anestezi seviyesi 4'e ulaşmak için gerekirse önerilen 168 mg / L (veya %0.0168)9konsantrasyondan yukarı veya aşağı titre ederek bir trikat konsantrasyon-yanıt çalışması yapın. Örneğin, bu çalışmada, 12-18 aylık vahşi tip AB zebra balığının% 0.02-0.04'lük bir tricaine çözeltisine daldırılması, 3 dakika içinde anestezinin 4. seviyesini indükleyecektir< / >
NOT: Anestezinin 4. seviyesinde denge ve kas tonusu tamamen kaybolur ve operküler hareket hızı azalır.
- Gerekirse, anestezik (ler) seçiminin uygunluğu ve uygulama yolu hakkında ek rehberlik için Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'ndeki (IACUC) veterinere danışın.
- Yetişkin bir zebra balığını, 3 dakika içinde anestezi seviyesi 4'ü indüklemek için önceden belirlenmiş en düşük ve IACUC onaylı konsantrasyonda (örneğin, bu çalışmada% 0.02-0.04) tricaine solüsyonu içeren bir tabağa daldırın (Şekil 1).
- Hayatta kalma EKG protokolü için, EKG kayıt oturumunu mümkün olduğunca kısa tutun (10 dakikadan az). 15 dakikadan kısa süren kısa EKG kayıt seansları için anestezi bakımı gerekli değildir.
- Saatlerce süren uzun EKG kayıt seansları için, bol miktarda hidrasyon ve oksijenasyon sağlamak için uzun etkili bir kas içi paralitik ve oral perfüzyon sistemi kullanın.
2. EKG kablosu yerleştirme
- Zebra balığı anestezi seviyesinin 4'ünü 3 saniye boyunca koruduktan sonra, balığı hemen EKG kurşun elektrotlarının yerleştirilmesi için ventral yüzeyi en üstte olacak şekilde nemli sünger yarığına aktarmak için bir çift künt forseps kullanın (Şekil 2).
- Ön düzlemde kardiyak ana eksenin sol kaudal-sağ kraniyal oryantasyonuna paralel bir bipolar kurşun oluşturmak için üç EKG kurşun elektrodunu balık kas sistemine yaklaşık 1 mm derinliğe kadar nazikçe yerleştirin.
- Pozitif (kırmızı) elektrodu ventral orta hatta bulbus arteriozus seviyesine, yani operkulumların iki alt kenarını birbirine bağlayan hayali bir çizginin 1-2 mm yukarısına yerleştirin (Şekil 2A).
- Negatif (siyah) elektrodu kaudal olarak ve 0.5-1.0 mm sola pozitif elektrotun yanal olarak, yetişkin zebra balığı ventrikülünün maksimum apikobazal uzunluğundan daha büyük bir mesafeye yerleştirin (Şekil 2A).
- Referans (yeşil) elektrodu anal bölgenin yakınına kaudal olarak yerleştirin.
NOT: Kardiyak ana eksen balıktan balığa biraz değiştiğinden, R ve T dalga genliklerini en üst düzeye çıkarmak için, deneme yanılma yoluyla yalnızca küçük, sistematik değişiklikler yaparak kurşun pozisyonlarını ayarlayın. Örneğin, her iki elektrot yerine bir elektrodu (pozitif veya negatif) aynı anda değiştirin ve rastgele yönlerde düzensiz değişiklikler yapmak yerine başka bir yöne geçmeden önce belirli bir yönde kademeli değişiklikler yapın.
3. EKG kaydı
- EKG veri toplama programını açın. Aralık, düşük geçiş ve yüksek geçiş için açılır menülerden istediğiniz bir ayarı seçin. Örneğin, bu deneyde kullanılan in vivo EKG kayıt sistemindeki aşağıdaki ayar, normal bir yetişkin zebra balığı için tutarlı, tatmin edici sinyal-gürültü oranı sağlar: aralık "2 mV", düşük geçiş "120 Hz" ve yüksek geçiş "0,03 s".
- 1 kHz örnekleme hızında sürekli boşluksuz EKG kaydını başlatmak için Başlat'a basın.
- Maksimum sinyal-gürültü oranı için kurşun konumlandırmasını optimize etmek için, EKG kaydını durdurmak için Durdur'a basın ve her kalp için ilk kayıt denemesinden kısa bir süre sonra EKG izini gözden geçirin. Yetişkin bir zebra balığı EKG'sinin normal olduğunu teşhis etmek için, aşağıdaki dört doğrulama kriterinin tümünün karşılandığını onaylayın (Şekil 3):
- Kriter 1: Tüm EKG dalga formlarının (P, QRS ve T) farklı ve kolayca görülebilir olduğundan emin olun.
- Kriter 2: P dalgasının pozitif olduğundan emin olun.
- Kriter 3: Net QRS kompleksinin pozitif olduğundan emin olun (yani R dalga genliği, Q ve S dalga genliklerinin toplamından daha büyüktür).
- Kriter 4: T dalgasının pozitif olduğundan emin olun.
- Normal bir EKG bekleniyorsa, gerekirse dört doğrulama kriterinin tümü karşılanana kadar elektrotları yeniden konumlandırın (önce negatif elektrodu deneyin).
- Normal bir T dalgası bekleniyorsa, ancak T dalgası çok küçükse, T dalgası genliğini en üst düzeye çıkarmak için elektrotları yeniden konumlandırın.
- Kurşun konumlandırmayı optimize ettikten sonra EKG kaydına devam edin. EKG taramalarını sonraki analizler için saklayın.
4. Anesteziden iyileşme
- EKG kayıt seansının sonunda, balığa zarar vermeden elektrotları dikkatlice çıkarın. Balıkları tricaine içermeyen taze, oksijenli balık suyuna aktarın.
- Anesteziden iyileşmeyi kolaylaştırmak için, balık normal solungaç hareketine veya yüzmeye devam edene kadar bir Pasteur pipeti ile solungaçların üzerine kuvvetlice su püskürtün.
- Balığın en az 5 saniye boyunca dik yüzme kabiliyeti ile belirtildiği gibi, anesteziden tam iyileşme için balığı izleyin (tipik olarak 1-2 dakika).
