Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Abstract

Kaynak: Muto, A., et al. İki Fotonlu Lazer Kullanılarak Bir Nöronal Popülasyonun Ablasyonu ve Zebra Balığı Larvalarında Kalsiyum Görüntüleme ve Davranışsal Kayıt Kullanılarak Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm.(2018)

Bu videoda av yakalama testi anlatılmaktadır. Video, belirli nöronların lazer ablasyonundan sonra zebra balığı larvalarının av yakalama davranışını inceleme yöntemini tartışıyor.

Protocol

1. Lazer Ablasyon Sonrası Davranışsal Sonuçların Değerlendirilmesi

1. Bir video kamera ile donatılmış bir stereoskoptan oluşan davranışsal bir kayıt sistemi kurun. Ticari veya ısmarlama uygun bir görüntü elde etme yazılımına sahip bir kamera kullanın (Şekil 1A).
2. Paramesyumun görüntü işleme ile algılanabilmesi için aydınlatma koşulunu optimize edin. Örneğin, ara parçalı halka beyaz bir LED ışık kullanın (Şekil 1B).
   Not: LED’e olan uzaklığı ve açısı, örneğin görünümünü etkiler (yani, koyu arka planda parlak veya parlak arka planda karanlık) ve bu nedenle başarılı görüntü işleme için kritik öneme sahiptir. Ara parçanın en iyi yüksekliğini belirleyin (Şekil 1C).
3. Bir zebra balığı larvasını (Bölüm 1’de açıklanan lazer ablasyon deneyinden elde edilen), orijinal üst contası çıkarılmış olarak davranışsal bir kayıt odasına (bir cam slayta takılmış) yerleştirin (Şekil 1D).
4. Bir mikropipet kullanarak beherden suda asılı duran 50 paramecia toplayın ve bunları kayıt odasına yerleştirin.
5. Kayıt odasının üstüne bir kapak fişi yerleştirin. Hazneye hava girmesini önlemek için kayıt haznesinin su yüzeyine yerleştirmeden önce kapak kızağına küçük bir damla su damlatın.
   Not: Bu adımda, paramecia içeren bir miktar su kayıt odasından taşacaktır. Kayıt odasında kalan paramecia sayısı yaklaşık 30-40 olacaktır.
6. Kayıt odasını (bir larva ve paramecia içeren) aydınlatma sistemine yerleştirin (Şekil 1D).
7. Hızlandırılmış kaydı 11 dakika (6.600 kare) boyunca 10 fps’de başlatın.
8. (İsteğe bağlı) Davranış açısından test edilen her larva için, lazer ablasyonunun etkinliğini doğrulamak için floresan mikroskobu ile lazerle ablasyonlu alanların floresansını gözlemleyin (yani, lazerle ışınlanmış alanda floresan hücrelerin yokluğu veya önemli ölçüde azaltılmış sayısı).
   Not: Işınlamadan sonra bile, ablasyondan sonra farklılaşan hücrelerde Gal4 gen ekspresyonunun daha sonra başlaması nedeniyle bazı floresan hücreler hala gözlenebilir.
9. Larvaların davranışını kaydettikten sonra, arka plandaki tekdüzelik eksikliğini telafi etmek için, Fiji’de her kareyi ortalama bir görüntüyle piksel piksel bölün: ‘İşlem’, ‘Görüntü Hesaplayıcı’, ‘İşlem: Böl’, ’32 bit (float) sonuç’ ve ‘Tamam’. Ortalama bir görüntü oluşturmak için ‘Görüntü’, ‘Yığınlar’, ‘Z-Projesi’, ‘Ortalama yoğunluk’ ve ‘Tamam’ı tıklayın (Şekil 1E, F).
10. ‘Analiz Et’, ‘Parçacıkları Analiz Et’e tıklayarak, tüm paramesiyaları kapsayan bir alan aralığı ayarlayarak, ‘Göster: Maskeler’ onay kutusunu işaretleyerek ve ‘Tamam’ı tıklayarak odada kalan paramecia sayısını sayın. ‘Göster:Maskeler’ seçeneği, her karedeki parçacık sayısının (paramecia) bir listesiyle birlikte çıkarılmış bir paramecia görüntüsü (Şekil 1G) sağlayacaktır.
11. Zaman içinde kayıt odasında kalan paramecia sayısını çizin. Paramecia sayısına ilişkin tahminler gürültülü olduğundan, elektronik tabloda 600 kare (1 dakika) aralığındaki her noktada hareketli bir ortalama gerçekleştirmenizi öneririz.

Representative Results

Materials

Imageing Chambers	Grace Bio-Labs	CoverWell Imaging Chambers PCIA-2.5	Used as a behavioral recording chamber
ORCA-Flash4.0 	Hamamatsu Photonics	Model:C11440-22CU 	A scientific CMOS camera
SZX7	Olympus		Stereoscope
A ring LED light	CCS  	Model: LDR2-100SW2-LA	White LED
Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth	Molecular Probes	Catalogue # S-24732	Used as a recording chamber in Ca imaging