Embriyo Bazlı Kimyasal Toksisite Ekranı: Zebra Balığı Embriyolarının Geliştirilmesi Üzerindeki Etkilerin Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Hao J. ve diğerleri, Büyük Ölçekli Zebra Balığı Tabanlı İn vivo Küçük Moleküllü Ekran. J. Vis. Uzm. (2010)

Bu makalede, zebra balığı embriyoları kimyasal toksisite taraması için kullanılmıştır. Kimyasal toksisite, fenotip okumaları ile ilişkilidir. Numune protokolü, kimyasal toksisite taramasının gerçekleştirilmesine yönelik metodolojik bir yaklaşımı göstermektedir.

Protokol

1. Küçük Molekül Kütüphanesinin Transferi

Bileşik transfer, robotik transfer yöntemleri ile otomatikleştirilebilirken, manuel transfer yöntemini anlatacağız.

1. Küçük molekül kütüphaneleri tipik olarak 96 oyuklu bir formatta sağlanır ve her bileşik DMSO'da 10 mM'lik bir stok olarak saklanır. Embriyolar, bileşiklerin ekleneceği aşamaya ulaşmadan yaklaşık 60 dakika önce, küçük moleküllerin alikotlarını (kaynak plakası) içeren istenen sayıda 96 oyuklu plakayı çözün. Kaynak plakalarının seri veya diğer kimlik numaralarını not edin. Plakalar üzerindeki yoğuşmayı en aza indirmek için, Drierite (W.A. HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH) içeren bir kurutma odasında çözülme meydana gelebilir.
2. Plakaları, çok kuyulu plaka adaptörü ile donatılmış bir masa üstü santrifüjde kısaca döndürün.
3. Alüminyum sızdırmazlık bandını kaynak plakasından çıkarın. 12 kanallı bir pipet kullanarak, kaynak plakasındaki bileşikleri 0,5 mM konsantrasyona kadar seyreltin (örneğin, 10 mM stoğun 250 nL alikotu ile başlıyorsanız, her oyuğa 4,75 μL DMSO ekleyin).
4. 96 oyuklu plakadaki (alıcı plaka) embriyolar istenen aşamaya ulaştığında, kaynak plakalardan 2.5μL bileşikleri (0.5mM) embriyoları içeren alıcı plakalara aktarmak için 12 kanallı (2-20 μL) bir pipet kullanın.
5. Kaynak plakaların kimlik numarasını alıcı embriyo plakalarına kaydedin. Şimdi embriyoları ve bileşikleri içeren alıcı plakaları kapaklarla kapatın, plakaları hafifçe döndürerek hafifçe karıştırın ve 28.5 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
6. Kullanılmayan küçük moleküller (0,5 mM) içeren her bir kaynak plakasını bir alüminyum sızdırmazlık bandı ile örtün ve uzun süreli saklama için -80°C'lik bir dondurucuya koyun.

>2. Fenotiplerin Görsel İncelemesi ile Küçük Moleküllerin Etkilerinin Taranması

1. Ekranı gerçekleştirmeden önce, neyin "isabet" teşkil edeceğine dair belirli bir kriter formüle edin.
2. Gelişimin istenen zamanlarında, bileşikle tedavi edilmiş embriyoları içeren 96 oyuklu plakaları inkübatörden çıkarın ve her bir kuyuyu bir stereomikroskop altında inceleyin. Dolaşım düzenindeki değişiklikler gibi ince değişikliklerin daha iyi görselleştirilmesi için, faz kontrastlı ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılabilir. Floresan mikroskobu, dokuya özgü bir promotör altında GFP veya DsRed proteinlerinin ekspresyonunun bozulmasını incelemek için kullanılabilir.
3. 96 oyuklu plakaları, 5 embriyodan en az 3'ünün öngörülen "isabet" fenotipini sergilediği herhangi bir kuyucuk için hızlı bir şekilde tarayın. Plakanın kimliğini ve her potansiyel isabetin kuyu konumunu kaydedin.
4. Bileşiğin etkilerini birkaç dozda (1 uM, 5 uM, 10 μM ve 50 μM) yeniden test ederek potansiyel bir isabeti yeniden doğrulayın. Her doz için, 10 embriyo 0.5 mL E3 ortamında 48 oyuklu bir plaka formatında test edilir. Yeniden test için bileşik eklemenin zamanlaması, orijinal taramanınkiyle aynı olmalıdır. Ortaya çıkan fenotip, bileşiğin yeniden test edilmesi üzerine yeniden üretildiğinde bir isabet doğrulanır
5. Kimyasal kütüphanedeki küçük moleküllerin veri tabanından isabet eden bileşiği tanımlayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMSO'da 10 mM stokta 96 wll formatında dizilmiş yapısal olarak çeşitli bileşiklerden oluşan küçük molekül kütüphanesi. Her ana plaka, 96 oyuklu polipropilen depolama plakalarına (Corning) aktarılır ve tarihine kadar -80 ° C'de saklanır. kullanmak.
Kurutucu	W.A. HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH
12 kanallı pipetler, 2-20 μL	Eppendorf Belediyesi
96 oyuklu plakalar için alüminyum sızdırmazlık bandı	Nunc, Rochester, NY
DMSO (Türkçe)	Sigma, St. Louis, MO
Temel inkübatör, 28.5 ° C	Balıkçı Bilimsel
Polistiren 96 oyuklu yuvarlak tabanlı tahlil plakaları	Corning COSTAR; Lowell, MA
İletilen ışık tabanlı stereomikroskop	Leica Mikro Sistemler, Bannockburn, IL
E3 embriyo ortamı: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 ,% 0.003 PTU (feniltiyokarbamid, Sigma; St. Louis, MO) içerir.			PTU, 0.3 g PTU'nun 1 L E3 embriyo ortamında çözülmesiyle 10x'lik bir çözelti olarak hazırlanabilir. PTU içeren solüsyonlar alüminyum folyo ile kaplanarak ışıktan korunmalıdır.