1. Embriyoların/larvaların hazırlanması
- 100 embriyoyu 25 ml yumurta suyu ile 100 mm'lik bir petri kabına aktarın. Petri kabı başına 100'den fazla embriyo tutmayın ve 28 ° C'de büyütün.
- Pigmentasyonu engellemek için, döllenmeden 10 saat sonra (hpf) petri kaplarına feniltiüre (PTU) ekleyin ve embriyoları/larvaları 80 hpf'ye kadar yükseltin. PTU'nun nihai konsantrasyonu 0.2 mM.
'dir
DİKKAT: PTU toksiktir. Uygun kullanım yönergelerine uygun olarak kullanın.
- Petri kaplarına %0.016'lık son konsantrasyonda 3-amino benzoik asit etil ester (Trikain) ekleyerek larvaları uyuşturun. Daha sonra, bir epifloresan mikroskobu kullanarak, CFP pozitif larvaları sıralayın. Benzer karaciğer boyutuna sahip larvaları kullanın ve daha küçük veya daha büyük karaciğere sahip olanları atın.
NOT: Yoğunluğu ne olursa olsun herhangi bir CFP pozitif larva kullanılabilir, çünkü hemizigot ve homozigot larvalar arasında hepatosit ablasyon derecesinde bir fark yoktur.
DİKKAT: trikain toksiktir. Uygun kullanım yönergelerine uygun olarak kullanın.
- Trikain içeren yumurta suyunu çıkarın ve 0.2 mM PTU ile takviye edilmiş yumurta suyunu ekleyin. Embriyoları/larvaları 28 °C'de tutun.
2. MTZ Tedavisi
- % 0.2 DMSO ve 0.2 mM PTU ile desteklenmiş 100 ml yumurta suyunda 0.171 g Mtz tozunu çözerek taze 10 mM Mtz çözeltisi hazırlayın. Mtz'yi tamamen çözmek için, çözeltiyi RT'de 20-30 dakika hızlı karıştırarak karıştırın. Mtz'yi çözündürmeye yardımcı olmak ve Mtz'nin larvalara nüfuz etmesini arttırmak için, Mtz.
hazırlarken DMSO ekleyin
DİKKAT: uzun süreli maruz kalma veya artan MTZ konsantrasyonu toksiktir. Uygun kullanım yönergelerine uygun olarak kullanın.
- İstenilen sayıda larvayı iki farklı 100 mm'lik petri kabına veya çok kuyulu plakaya aktararak larvaları kontrol ve deney gruplarına ayırın. Deney grubu için larvaları 10 mM Mtz çözeltisinde tutun; kontrol grubu için,% 0.2 DMSO içeren yumurta suyunda tutun.
- Mtz'nin foto-inaktivasyonunu önlemek için Mtz çözeltisini içeren plakaları veya petri kaplarını alüminyum folyo ile örtün ve 28 °C'de inkübe edin. Mtz tedavisinin süresi larva aşamasına ve transgenik çizgiye bağlıdır.
3. Biliyer Güdümlü Karaciğer Rejenerasyonunun Analizi
- Ablasyon süresinin sonunda, Mtz solüsyonunu plakalardan çıkarın. Mtz ile muamele edilmiş larvaları 25 ml yumurta suyu ekleyerek yıkayın. Yumurta suyunu atmadan önce larvaları yıkamak için plakayı 2-3 kez döndürün. Üç kez tekrarlayın ve ardından larvaları bir kez daha yumurta suyuna batırın. Mtz ile tedavi edilen larvalarda kalp ödemi ve larva ölümünü önlemek için, larvaları hareketsiz hale getirmek için %0.008'lik nihai konsantrasyonda daha düşük bir Trikain konsantrasyonu ekleyin.
- Karaciğer analizi için, MTZ ile tedavi edilen larvaların karaciğer boyutunu CFP filtreli bir epifloresan mikroskobu altında inceleyin. Göreceli karaciğer boyutuna göre hepatosit ablasyon seviyelerini değerlendirin: büyük (ablasyonsuz;% 0-10 larva), orta (kısmen ablasyonlu;% 10-20) ve çok küçük (tamamen ablasyonlu;% 80-90).
