Morfolino Enjeksiyonu: Zebra Balıklarında İşlevi İncelemek İçin Hedef Gen Ekspresyonunu Yıkmak İçin Bir Yöntem

Abstract

Kaynak: Hyde D.R., et al. Morpholinos'un Yenileyici Yetişkin Zebra Balığı Kuyruk Yüzgecine İn vivo Elektroporasyonu. J. Vis. Uzm. (2012)

Protokol, zebra balığında gen ekspresyonunun kuyrukta morfolino enjeksiyonu ile hedefli olarak yok edilmesini açıklar.

Protocol

1. Morfolino Enjeksiyonu

1. Morpholino enjekte etmeden bir gün önce bir enjeksiyon plakası yapın (Şekil 1). Kuyunun bir ucunda bir çentik kestiğinizden emin olun, bu da mikroenjeksiyon prosedürü için balığın stabilize edilmesine yardımcı olur.
2. Floresein etiketli morfolinoyu uygun konsantrasyona seyreltin (1,2 mM ile başlamanız önerilir) ve 5 dakika boyunca 65 ° C'lik bir su banyosuna koyun.
3. İğneyi morfolino ile yükleyin (not: geri doldurmanıza veya önden yüklemenize bağlı olarak, iğneniz önce iğneyi mi yüklediğinizi yoksa önce ucu mu keseceğinizi belirleyecektir).
4. İğnenin ucunu belirli bir açıyla kesin.
5. Enjeksiyon başına yaklaşık 5 nl'lik bir morfolino kabarcığı enjekte etmek için mikro enjeksiyon sisteminizin talimatlarını izleyin. Daha büyük hacimlerde morfolino dokuyu bozabilir.
6. Balıkları uyuşturun ve enjeksiyon plakasına yerleştirin. Fazla sıvıyı çıkarın ve iğneyi kemik ışınının hemen distalinde uygun yere yönlendirin (Şekil 2). Morfolino enjeksiyonları için uygun bir mikroskop ve mikroenjeksiyon aparatı kullanarak (Spesifik Reaktifler Tablosuna bakınız), morfolinoyu Şekil 2'de gösterildiği gibi yüzgecin içine önden arkaya doğru enjekte edin. Arkadan öne doğru enjeksiyon, enjeksiyon sırasında yüzgeç dokusunun yuvarlanmasına neden olur ve çok zordur.
7. İğneyi nazikçe rejeneratif dokuya, her bir kemik ışınının hemen distaline (Şekil 2'de "1" ile işaretlenmiştir) ve blastema yerleştirilene kadar (Şekil 2'de "2" ile işaretlenmiştir) distal olarak itin. İğneyi tüm yüzgeçten geçirmemeye dikkat edin. İğne doğru bir şekilde lokalize edildiğinde, morfolinoyu enjekte edin (yani bir kez tıklayın). 1,2 mM'de, floresein etiketli morfolino çözeltisi, normal ışık koşullarında bile sarı-yeşil görünür. Her enjeksiyonda, enjeksiyonun blastema lokalizasyonuna yardımcı olan sarı bir morfolino çözeltisi "pufu" görselleştirilebilir. Kemik ışını başına yaklaşık 75 nl (10-15 tıklama) morfolino çözeltisi enjekte edilmelidir. Tıklamalar arasında ~ 1 saniye duraklayın. Sadece dorsal tarafa enjekte ediyoruz, ventrali sadece elektroporasyon kontrolü olarak kullanıyoruz.

Results

Şekil 1. A. Agarozdan yapılmış ve morfolino mikroenjeksiyonu sırasında balığı tutmak için küçük bir kuyu içeren enjeksiyon plakasının şeması.

Şekil 2. Morfolino mikroenjeksiyonunun şeması. A. Balığı, balığın başı kuyudan kesilen çentiğe gelecek şekilde tabağa yerleştirin, bu da...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Morfolino Çiçeği	Gen Araçları, LLC		Morpholino, ilgilendiğiniz proteine göre özel olarak tasarlanmalıdır
Mikro enjeksiyon pompası	Dünya Hassas Aletler A.Ş.	PV830	Pnömatik PicoPump Birçok farklı mikroenjeksiyon sistemi kullanılabilir
Mikro manipülatör	Dünya Hassas Aletler A.Ş.	MMJR (İngilizce)	Sağ elini kullanan (sol elini kullananlar için MMJL)
Mikro enjeksiyon iğneleri, 1,0 mm dış çap	Dünya Hassas Aletler A.Ş.	1B100F-4	Bunlar bir iğneye çekilmiş borosilikat cam kılcal damarlardır
İğne tutucu	Dünya Hassas Aletler A.Ş.	5430-TÜMÜ	Pico Nozul Kiti; 1.0 mm pipet contasını taktığınızdan emin olun
İğne çektirme	Sutter Enstrüman A.Ş.	P-97	Diğer mikropipet/iğne çektirmeleri de çalışmalıdır
mikroskop	Leica, Nikon, Zeiss	Sayı üreticiye göre değişir	20X optikli herhangi bir stereomikroskop ve mikromanipülatörlerle çalışma yeteneği
2-Fenoksietanol	Sigma-Aldrich	77861-1L	Anestezi; işlem için balık sistemi suyunda 1:1000, ötenazi için 1:500 oranında seyreltin