Çiftleşme ve yumurta evreleme: embriyo oluşturmak ve bunları gelişim aşamasına göre sıralamak için bir yöntem

Abstract

Kaynak: Hostelley T.L., et al. Zebra Balığından RNASeq Tabanlı Gen İfade Verilerinin Numune Hazırlama ve Analizi. J. Vis. Uzm. (2017)

Makale, doğal çiftleşme ve gelişim aşamalarını sıralama yoluyla zebra balığı embriyoları oluşturmak için bir protokolü açıklamaktadır. Protokol, transgenik balıklar kullanılarak pankreas β hücrelerinin analizi için daha fazla kullanılır.

Protocol

1. Doğal çiftleşme yoluyla embriyo oluşturma

1. Kültür embriyoları 3 aylık, üreme olgunluğu.
2. Embriyo toplamadan önceki akşam yetişkin erkek ve dişi balıkları istenen suştan bölünmüş çiftleşme tanklarına ayırın ve her tanka 2 erkek ve 3 dişi ekleyin.
   NOT: Transgenik insülin2a:mCherry floresan raportör suşunun kullanılması, pankreas β hücrelerinin analizine izin verdi.
3. Balıkları taze sistem su ile çiftleşme tankına aktarın ve ertesi sabah ışıklar yandıktan hemen sonra bölücüyü çıkarın.
4. Alt tankta embriyolar gözlenene kadar balığın doğal olarak çiftleşmesine izin verin. İstenilen miktar toplanana kadar embriyoları 30 dakikalık aralıklarla toplayın. Toplanan her zaman noktasını 28,5 ° C'de embriyo ortamında ayrı Petri kaplarında saklayın.
5. İstenirse, genetik materyalin mikroenjeksiyonunu yapın veya deneysel kültür ortamına yerleştirin ve embriyoları taze Hank'in embriyo ortamında 28.
   sıcaklıkta 10 cm'lik Petri kaplarında kültürleyin NOT: Morfolino (MO) enjekte edilmiş veya mutant hayvanlarda gen ekspresyonu analizi için, her manipülasyonun gen ekspresyonu üzerinde tesadüfi etkileri olabileceğini unutmayın. Mutantlar, MO tabanlı gen hedefleme tarafından gözlenmeyen transkripsiyon seviyesinde genetik tazminat sergileyebilir.

2. Aşama embriyoları

1. Tüm embriyoların tutarlı gelişimsel zamanlamasını teşvik etmek için embriyoları 10 cm'lik Petri kabı başına 50-75 embriyoluk gruplar halinde kültürleyin.
2. Gelişimsel ilerlemeyi sağlamak için blastomer, epiboli ve somit aşamalarında diseksiyon mikroskobu kullanarak gelişimsel morfolojiyi izleyin.
   NOT: Tabakta gelişimsel gecikmeyi önlemek için ölmekte olan veya hatalı biçimlendirilmiş embriyoları çıkarın.
3. Embriyoları gelişim yaşına göre ayırın. 24 hpf.
   sonra toplam vücut uzunluğunu kullanarak embriyoları ve larvaları sahneleyin NOT: Somitler, embriyonun dorsal kısmında bulunan chevron şeklindeki mezodermal dokudur.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ins2a:mKiraz	ZIRC (Türkçe)	ZL1483
Çiftleşme tankları 1.0L Geçiş Tankı Seti	Su ürünleri yetiştiriciliği	ZHCT100
Diseksiyon Mikroskobu	Zeiss