Kuyruk Klibinden DNA Ekstraksiyonu: Zebra Balığı Genotiplemesinde Kullanılan Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Xing L., et al. Yüksek Çözünürlüklü Eriyik Analizi ile PCR Kullanarak Hızlı ve Verimli Zebra Balığı Genotiplemesi. J. Vis. Uzm. (2014).

Bu makalede, zebra balığı kuyruk klipsinden DNA ekstraksiyonu açıklanmaktadır. Protokol, zebra balığı genotiplerini analiz etmek için hızlı ve verimli bir yöntem göstermektedir.

Protokol

1. DNA Hazırlama

1. DNA lizis tamponu hazırlayın: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.3, %0.3 Tween 20, %0.3 NP40. Kullanım gününde 1 mg / ml'lik son konsantrasyona taze Proteinaz K ekleyin.
2. Doku toplama:
   1. Yetişkin balık yüzgeci klipsi için:
      1. Balıkları uyuşturun: Balıkları %0.004 MS-222 (trikain) çözeltisine koyun. Solungaç hareketi yavaşlayana kadar bekleyin.
      2. Balıkları 5-10 Kimwipes'lık bir yığının üzerine koyun ve steril bir tıraş bıçağıyla kuyruk yüzgecinin yaklaşık 2-3 mm'lik küçük bir parçasını kesin.
      3. Balıkları geri kazanım için temiz su ile etiketli bir tanka hızlı bir şekilde yerleştirin; hem tankı hem de yüzgeç klipsini içerecek olan ilgili tüpü dikkatlice etiketleyin. Suyu değiştirin ve balıkları her gün besleyin.
      4. Kanat klipsini steril bir pipet ucuyla alın ve 100 μl DNA lizis tamponu ile doldurulmuş bir tüpe aktarın.
      5. Pipet ucunu atın ve tıraş bıçağını keskin bir kaba atın.
   2. Embriyo kuyruk klipsi için:
      1. Embriyoları %0.004 MS-222 (trikain) çözeltisine yerleştirin. 2 dakika bekleyin.
      2. Diseksiyon mikroskobu altında forseps ile bir parça kuyruk kesin.
      3. Kuyruğu 30 μl DNA lizis tamponu ile doldurulmuş etiketli bir tüpe koyun.
      4. Embriyoyu hızlı bir şekilde 100 μl% 4 paraformaldehit içeren bir tüpe koyun.
      5. Tüpleri embriyolarla ve bunlara karşılık gelen kuyruk tüpleriyle etiketleyin.
      6. Embriyolu tüpleri fiksasyon için gece boyunca 4 ° C'de saklayın.
      7. Kontaminasyonu en aza indirmek için forsepsleri her embriyo arasında Milli-Q su ve Kimwipes kullanarak temizleyin.
   3. Bütün embriyolar için:
      1. Embriyoları %0.004 MS-222 (trikain) çözeltisine yerleştirin. 2 dakika bekleyin.
      2. 100 μl DNA lizis tamponu ile doldurulmuş bir tüpe 1-5 embriyo koyun. Dekoryonasyon gerekli değildir.
3. DNA sindirimi
   Tüpleri doku ile (yüzgeç veya kuyruk klipsleri veya embriyolar) 55 ° C'de 4 saatten gece boyunca inkübe edin.
4. Proteinaz K
   inaktive edin Tüpleri 15 dakika boyunca 95 ° C'ye ısıtın DNA hemen PCR için kullanılmalı veya -20 ° C'de 3 aya kadar saklanmalıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
100 Reaksiyon LightScanner Ana Karışımı	Biyolojik Yangın	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
Trikain
Paraformaldehit