Işık Levha Mikroskobu Numune Hazırlama: Uzun Süreli Görüntüleme için Canlı Zebra Balığı Embriyolarının Montajı

Abstract

Kaynak: Icha J., et al. Zebra Balığı Gözü Gelişimini Görüntülemek için Işık Tabakası Floresan Mikroskobu Kullanma. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu makalede, ışık tabakası floresan mikroskobu için numune hazırlama açıklanmaktadır. Ayrıca, uzun süreli görüntüleme için canlı zebra balığı embriyolarını monte etmek için bir yöntem gösterir, bu da canlı embriyoların uzun süreli filmlerinin kaydedilmesine izin verir.

Protocol

1. Numune Hazırlama

1. Agaroz Karışımının Hazırlanması
   1. Agaroz karışımını yapmadan 15 dakika önce, 70 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma bloğunda %1 düşük erime noktalı agarozdan (E3 ortamında çözülmüş) 1 ml'lik bir alikotu eritin. Agaroz tamamen eridikten sonra, 600 μl'yi 1,5 ml'lik taze bir tüpe aktarın, 250 μl E3 ortamı, 50 μl% 0,4 MS-222 ve 25 μl girdaplı boncuk stoğu çözeltisi ekleyin.
      not: Bu, karışımın 925 μl'sini oluştururken, daha sonra embriyolarla birlikte eklenen sıvı için ek 75 μl hesaplanır.
   2. Tüpü 38-40 ° C'de ikinci bir ısıtma bloğunda tutun veya örnek embriyoları içine koymadan önce agarozun jelleşme noktasına çok yakın olduğundan emin olun.
2. Embriyoların Yerleştirilmesi
   1. 20 μl hacimli (siyah işaretli, ~1 mm iç çaplı) beş cam kılcal damar alın ve eşleşen Teflon uçlu pistonları bunlara yerleştirin. Teflon ucu kılcal damarın dibinde olacak şekilde pistonu
   kılcal damardan itin.
   2. Beş embriyoyu (bir kerede monte edilebilen bir sayı) bir cam veya plastik pipet ile girdaplı 37 °C ılık agaroz karışımı tüpüne aktarın.
      not: Embriyolarla birlikte minimum miktarda sıvı taşımaya çalışın.
   3. Kılcal damarı karışıma yerleştirin ve pistonu yukarı çekerek bir embriyoyu içine emdirin. Embriyonun başının kuyruktan önce kılcal damara girdiğinden emin olun. Piston ile numune arasında herhangi bir hava kabarcığı oluşmasını önleyin. Embriyonun üzerinde ±2 cm, altında ise ±1 cm agaroz olmalıdır. Kalan embriyolar için tekrarlayın.
   4. Agaroz tamamen katılaşana kadar bekleyin, bu birkaç dakika içinde gerçekleşir ve ardından numuneleri hamuru veya bantla bir beherin duvarına yapıştırarak E3 ortamında saklayın. Kılcal damarın alt açıklığı, numuneye gaz değişimine izin verecek şekilde çözelti içinde serbest bırakılmalıdır.
      NOT: Bölüm 1.1 ve 1.2'ye benzer bir protokol, http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation OpenSPIM wiki sayfasında da bulunabilir.

2. Örnek Konumlandırma

1. Numune Tutucu Tertibatı
   1. Numune tutucu gövdesine doğru boyutta (siyah) 2 plastik kılıfı birbirine karşı yerleştirin. Yarık tarafları dışa bakmalıdır. Kelepçe vidasını 2-3 tur çevirerek gevşek bir şekilde takın. Kılcal damarı kelepçe vidasından geçirin ve diğer tarafta siyah renkli bant görünene kadar tutucunun içinden itin. Pistona dokunmaktan kaçının.
   2. Kelepçe vidasını sıkın. Embriyonun altındaki 1 cm'lik fazla agarozu kılcal damardan dışarı itin ve kesin. Sapı numune tutucu diske yerleştirin.
   3. Yazılımda mikroskop aşamasının yük konumunda olduğunu onaylayın. Numune ile birlikte tüm tutucuyu mikroskoba dikey olarak aşağı doğru kaydırmak için kılavuz rayları kullanın. Manyetik tutucu disk yerine kilitlenecek şekilde çevirin.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Işık tabakası Z.1 mikroskobu	Carl Zeiss Mikroskobu
Düşük erime noktalı agaroz	Roth	6351.1
Düşük erime noktalı agaroz	Sigma	A4018 veya A9414
Etil 3-aminobenzoat metansülfonat (MESAB / MS-222 / Trikain)	Sigma	E10521
20 μl (1 mm iç çap, siyah işaretli) kılcal damarlar	dağlamak	701904	Transferpettor için yedek parça olarak satılır
20 μl kılcal damar için teflon uçlu pistonlar	dağlamak	701932	Transferpettor için yedek parça olarak satılır