$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Embriyoların hazırlanması
- Çiftleşmeden sonra, embriyoları E3'te bir Petri kabında toplayın ve montajdan önce yaklaşık 28 saat boyunca 26.5 ° C'de inkübe edin.
not: Bu, embriyoların gelişimini yavaşlatır, böylece embriyolar görüntülemenin başlangıcında yaklaşık 30 somit aşamasındadır.
- E3'te embriyoları %0.016-0.020 Trikain içinde uyuşturun. Pigmentasyonu engellemek için, 200 μM'lik bir konsantrasyona PTU ekleyin.
- Diseksiyon mikroskobu altında forseps kullanarak embriyoları dekoryonlayın. İki forseps kullanarak, embriyoyu serbest bırakmak için koryonu kavrayın ve nazikçe ayırın.
2. Agaroz içine montaj
>NOT: Geliştirilen montaj yöntemi, E3'te gerektiğinde %0.02 Trikain ve PTU ile iki farklı konsantrasyonda düşük eriyik agaroz gerektirir. İlk agaroz çözeltisi, distorsiyon ve motilitenin minimumda olduğu optimal bir agaroz konsantrasyonu içerir. Optimizasyon, aşağıdaki 5. adımda açıklanmıştır.
- İki katman için agaroz çözeltilerini (aşağıda adım 5'te tanımlanan konsantrasyon ve% 1) 65 ° C'ye ısıtın. Embriyonun ısıdan zarar görmemesi için agarozun montajdan hemen önce yaklaşık 30 °C'ye kadar soğumasını bekleyin. Montaj için, 0 No'lu kapaklı cam tabanlı 35 mm cam tabanlı tabaklar kullanın. Tabağın dibine tutturulan kapak camı, embriyonun yerleştirileceği 10 mm sığ (yaklaşık 1,2 mm derinliğinde) bir kuyu oluşturur.
not: Bu durumda, en az motilite ve distorsiyona sahip konsantrasyon% 0.025 ila% 0.040 agaroz arasındaydı.
- Bir cam pipet veya mikropipet kullanarak yan taraflarından biri tabağın dibine doğru dekoryonlu bir embriyoyu nazikçe yerleştirin. Bir mikropipet kullanıyorsanız, embriyoya uyacak şekilde açıklığın boyutunu artırmak için ucun dış kısmını kesin (Şekil 1A). Kalan E3'ü bir mikropipetle dikkatlice çıkarın.
- Embriyoyu örtmek için tabağın dibine tutturulmuş kapak camının oluşturduğu küçük oyuğa ilk agaroz solüsyonunu ekleyin (Katman 1) (Şekil 1B). Agarozun küçük kuyuyu kapladığından ancak taşmayacağından emin olun.
- İki kapak camı arasında embriyo ile dar bir agaroz dolu alan oluşturmak için küçük kuyuyu bir kapak camı (22 mm x 22 mm) (Şekil 1C) ile örtün.
- Kapak camının üzerine, tabağın tabanının her yerine (Katman 2) %1'lik bir agaroz çözeltisi tabakası yerleştirin (Şekil 1D). Bu tabaka katılaştıkça kapak camını yerinde tutar.
- Sistemi nemli tutmak için tabağın kalan kısmını %0,02 Trikain içeren E3 ile doldurun (Katman 3) (Şekil 1E).
not: Bu kurulumda kapak camı ve %1'lik agaroz alt tabakanın seyrelmesini önler.
3. Katman 1 için agaroz çözeltisinin optimizasyonu
- Katman 1 için en uygun agaroz konsantrasyonunu belirlemek için çok ölçekli bir ızgara arama yaklaşımı kullanın. Embriyoları %0.01 ila %1 arasında değişen artan agaroz konsantrasyonlarında monte edin, ardından görüş alanında embriyo büyümesi kısıtlaması ve hareketliliğinin hızlandırılmış görüntülenmesi. Hem distorsiyonun hem de motilitenin minimumda olduğu konsantrasyonları belirleyin.
- Agaroz konsantrasyonunu daha da optimize etmek için, embriyoları daha ince bir agaroz konsantrasyonu aralığı kullanarak monte edin (ör., adım 3.1'de en iyi bulunan konsantrasyona bağlı olarak (ör.% 0.025,% 0.028,% 0.031, vb.).
not: Laboratuvarımızda optimal agaroz konsantrasyonu %0.03 civarındaydı.
