$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Mikroskop Kurulumu, Görüntü Toplama, İşleme ve Analiz
- % 0.8 düşük erime noktalı (LMP) agaroz hazırlayın: 100 ml E3'e 0.8 g LMP agaroz ekleyin ve tamamen eriyene kadar ısıtın. Sıcakken, 1 ml LMP agarozu 37 °C'lik bir ısıtma bloğunda 1.5 ml'lik mikrofüj tüplerine alın. LMP agarozu 37 °C'de erimiş kalacaktır. 37 ° C'de her 1 ml LMP agaroz alikotuna 40 μl 4 mg / ml (25x), pH 7.0 trikain ekleyin. NOT: Pigmentli bir suşla çalışıyorsanız, her 1 ml'lik alikota 20 μl %0.15 (50x) PTU ekleyin.
- Kalan LMP agarozu birkaç ay boyunca 4 ° C'de kapalı 50 ml'lik tüplerde saklayın.
- Embriyoların hali hazırda içinde bulunduğu 25 ml E3'e 1 ml 4 mg/ml (25x), pH 7.0 trikain eklenerek görüntülenecek parabiyotik embriyoları uyuşturun.
- Çanağı yavaşça döndürün, böylece embriyolar ortada toplanır. Daha sonra, geniş uçlu bir plastik transfer pipeti kullanarak, embriyoları mümkün olduğunca az sıvı içinde çizin. Pipeti dik çevirin ve embriyoları pipetin en altına yerleşecek şekilde nazikçe zıplatın.
- Embriyolar pipetin dibindeyken, pipet ucunu agarozun yüzeyine hafifçe dokundurarak 1 ml'lik bir LMP agaroz alikotuna aktarın. Agarozu seyrelteceği için fazla sıvıyı aktarmaktan kaçının.
- Fazla sıvıyı pipetten dışarı attıktan sonra, agaroz içindeki embriyoları nazikçe karıştırmak için pipeti kullanın, ardından pipeti kullanarak tüm agarozu ve embriyoları cam tabanlı bir kuyuya (No. 1.5 lamel ) aktarın, 6 oyuklu plaka.
not: Embriyoları görüntüleme plakasına aktardıktan sonra pipeti attığınızdan emin olun. Artık agaroz pipetin içine yerleşecek ve daha sonraki kullanım için etkisiz hale getirecektir. Bunun yerine, her seferinde yeni bir pipet kullanın.
- Bir stereoskop altında, embriyoları kapak camına doğru (mikroskop objektifinin çalışma mesafesinde olduklarından emin olmak için) ve görüntüleme için istenen yönde konumlandırmak için ahşap saplı bir alay iğnesinin ucuna sabitlenmiş jel yüklemeli bir pipet ucu kullanın.
not: Agaroz tamamen ayarlanana kadar sürekli olarak yeniden konumlandırın. Parabiyotik embriyoları, çiftin embriyosunun görüntüleneceği duruma göre monte etmeye özen gösterin. Yapışık embriyoların rastgele yönelimi göz önüne alındığında, bazı çiftler için her iki embriyoyu da görüntülemek zor olabilir. Bu senaryoda, forseps ve geniş uçlu bir plastik transfer pipeti kullanarak embriyoları agarozdan kurtarın ve ardından farklı bir perspektiften görüntüleme için yeniden monte edin.
- Agaroz sertleştikten sonra, trikain (ve gerekirse PTU) ile desteklenmiş 2-3 ml E3 ile örtün.
- Embriyoları ters çevrilmiş geniş alanlı epi-floresan, lazer taramalı konfokal veya dönen disk konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin. İstenen görüntüleme için en uygun hedefi seçin. Tüm embriyo görüş alanı için 4x objektif kullanın. Belirli bir dokuyu görüntülemek için 20x objektif gibi daha yüksek bir büyütme seçin
not: Dik bir mikroskop kullanıyorsanız, LMP agarozu (yukarıdakine benzer) bir cam kapak kızağı üzerine monte edin. Cam lameli aynı E3-trikraine-PTU ile doldurulmuş bir vakumlu gres halkasına sahip bir cam mikroskop lamına ters çevirin.
- NIH Image J/FIJI.
gibi ücretsiz görüntü analizi yazılım paketlerini kullanarak elde edilen görüntüleri işleyin
not: Segmentasyon ve izleme algoritmalarını kullanarak hücre sayılarını sayın ve hücre göçü ve hücre bölünmesi gibi dinamikleri ölçün.