1: Bukalemun Ti-Safir lazer ile özel yapım iki fotonlu mikroskop kullanılarak iki fotonlu aksotomi
- Görüntüleme için hazırlanın. Monte edilmiş embriyo (lar) ı mikroskop altında bir slayt tutucuya yerleştirin. 40X (0.8 NA) su hedefi olan bir embriyoya odaklanın. Lazeri açın. Aşağıdaki parametreleri kullanarak GFP eksprese eden nöronları tekrarlanabilir bir şekilde görselleştirebildik ve hasar verebildik. Aksonları zarar vermeyen bir güçte görselleştirmek için, lazeri 910 nanometre (nm) dalga boyuna ve 30 miliwatt'lık bir güce ayarlayın (mW, numunedeki güç miktarıdır). Görüntüleme yazılımını açın. Karel Svoboda'nın laboratuvarında geliştirilen ScanImage Yazılımını kullanıyoruz.
- Embriyoyu iki fotonlu lazerle taramak, aksotomize etmek istediğiniz aksonu bulmak ve bu aksonun bir görüntüsünü yakalamak için odaklamaya basın. İlk ve son Z konumlarını işaretleyin, görüntüyü elde edin ve Z yığınlarının maksimum projeksiyonunu yapın.
- Aksotonize etmek istediğiniz aksonun dalını 70X yakınlaştırın ve taramayı durdurun. Numunedeki mW'yi 180 mW'lık zarar verme gücüne yükseltin ve lazerle tek bir tarama yapın. Bunu, Z dilimlerinin sayısını 1 olarak ayarlayarak ve "Yakala" düğmesine basarak yapıyoruz. Bu, aksonu koparmak için yeterli olmalıdır. Mikroskobunuz ve deneysel hedefiniz için bu prosedürü optimize etme yöntemleri için tartışmaya bakın.
- Uzaklaştırın, gücü 30 mW'a düşürün ve bir görüntü çekin.
2: Zeiss 510 konfokal/iki fotonlu mikroskopta iki fotonlu aksotomi
- Monte edilmiş embriyoyu sahneye yerleştirin ve 25X su hedefi veya başka bir uygun hedef kullanarak odak noktasına getirin.
- İki foton (910 nm) ve Argon (488 nm) lazerleri çok kanallı bir ortamda açın, böylece birinden diğerine geçmek mümkün olur. Her iki lazer de GFP'yi tespit etmek için kullanılsa da, iki foton emisyonu kırmızı ile görselleştirilir ve argon lazer emisyonu ikisini ayırt etmek için yeşil ile görselleştirilir.
- Yaralanacak bir aksonu tanımlamak için Argon lazerini kullanın. Z ayarları altında, ilk ve son optik bölümleri işaretleyin. Konfokal bir görüntü çekin ve Z yığınının maksimum projeksiyonunu oluşturun.
- Aksonun yaralanacak bölgesini seçin ve bu bölgeyi odak noktasına getirin. Argon lazeri kapatın ve iki fotonlu lazeri açın. Aksonun hala odakta olduğundan emin olmak için numuneyi iki fotonla ~% 9 iletim lazer yoğunluğunda tarayın.
- Kırpma aracının kullanılabilir olması için "durdur" düğmesine tıklayın. İlgilendiğiniz alanı yakınlaştırmak için kırpmayı kullanın. Genellikle ~ 70X'e yakınlaştırırız (yakınlaştırma "mod" sekmesi altında kontrol edilebilir). "Kanallar" sekmesi altında, iki fotonun yoğunluğunu ~%9 iletimden %15-20 iletime değiştirin.
- Bir aksonu kesmek için "hızlı XY" düğmesini yaklaşık 1 saniye etkinleştirin ve ardından aşırı hasarı önlemek için durdur düğmesine basın. Prosedür işe yaradıysa akson dağınık döküntü olarak görülmelidir.
- Aksonun hasar gördüğünden emin olmak için 488 nm Argon lazere geri dönün, başka bir konfokal görüntü alın ve maksimum bir projeksiyon oluşturun.