$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Davranış Deneyleri için Larva Dağı
- ddH2O'da %1,5 düşük eriyik agaroz yapın ve katılaşmasını önlemek için 42 °C'lik bir ısı bloğunda saklayın.
- Bir cam Pasteur pipeti kullanarak, önceden taranmış larvalardan birini mümkün olduğunca az mavi / embriyo su ile% 1.5 düşük eriyik agaroz tüpüne aktarın.
- Larvaları bir damla agaroz içinde küçük bir Petri kabına aktarın.
- Diseksiyon mikroskobu altında, larva dorsalini yukarı doğru konumlandırın.
- Agaroz katılaştığında, agarozu ince bir tıraş bıçağıyla (# 11 neşter) kesin ve tüm larva etrafında bir agar kama bırakın.
- Sarının her iki tarafında iki çapraz kesim yapın; larvaları çentiklememeye dikkat edin.
- Agarozu çevreleyen alanı embriyo / mavi su ile doldurun.
- Agarozu larvanın gövdesinden ve kuyruğundan uzaklaştırın (Şekil 1).
2 . Yüksek Hızlı Kamera ve Görüntüleme Yazılımı Hazırlayın
- Yüksek hızlı kamerayı diseksiyon dürbününe monte edin.
- Kamerayı bilgisayara bağlayın.
- Bilgisayarı aç.
- Yüksek hızlı kamerayı açın.
- Video/görüntüleme yazılımını açın (AOS görüntüleme yazılımı kullanıyoruz ve burada kullanma prosedürlerini açıklayacağız, ancak diğer görüntüleme yazılımları da aynı derecede kabul edilebilir).
- Kamera ayarlarını buna göre ayarlayın (ör. saniyede 1.000 kare (fps), %50 tetik arabelleği veya diğer tercih edilen ayarlar).
- Kayda başla.
>3. 473 nm Lazer Kullanarak Tek Nöronları Etkinleştirin
- Stimülatörü, lazeri ve optik kabloyu takın.
- Stimülatörü açın.
- Stimülatörü maksimum 5 Volt'a ve 5 msn'lik bir darbe süresine ayarlayın.
- Lazeri üreticinin talimatlarına göre açın.
- Optik kablonun ucunu ChEF-tdTomato ekspresyonu olan bir nöronun hücre gövdesine yakın konumlandırmak için bir diseksiyon mikroskobu kullanın (Şekil 1).
- Duyusal nöronu aktive etmek için mavi ışık darbesi verin.
- Saniyede 500 veya 1.000 kareye ayarlanmış yüksek hızlı bir kamera kullanarak davranışı kaydedin.
- Deneyi istediğiniz gibi tekrarlayın, alışkanlığı önlemek için her aktivasyon arasında 1 dakika bekleyin. (Her nöron için en az üç yanıt kaydediyoruz).
- Larvaları serbest bırakmak için, hayvana zarar vermemeye dikkat ederek agarozu forseps ile ayırın. Bu hayvanın daha fazla gelişmesine izin verilebilir ve davranışın gelişimini karakterize etmek için prosedür daha eski bir aşamada tekrarlanabilir. Embriyo ayrıca, aşağıda tarif edildiği gibi, davranışı hücresel yapı ile ilişkilendirmek için aktive edilmiş hücrenin yüksek çözünürlüklü konfokal görüntülemesi için yeniden monte edilebilir.
- Larvaları taze mavi / embriyo suyu ile kültür plakasına aktarın. Tek tek larvaları takip etmek için 24 oyuklu bir plaka kullanıyoruz.
