Tüm Hücre Yama Kelepçesi Elektrofizyolojisi: Nöronların Elektriksel Özelliklerini İncelemek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Roy, B., et al. Embriyonik Zebra Balığı Mauthner Hücrelerinden Yama Kelepçesi Kayıtları. J. Vis. Uzm. (2013).

Bu protokol, zebra balığı embriyolarında Mauthner nöronlarının ve diğer retikülospinal hücrelerin elektriksel özelliklerini incelemek için bir yöntem olan tam hücre yama kelepçesi elektrofizyolojisi adı verilen bir tekniği tanımlar.

Protokol

1. Yama Kelepçesi Kaydı (Tüm Hücre Modu)

1. Tüm kayıtlar tüm hücre yaması kelepçe modunda gerçekleştirilir. Kayıt odaları, bir elektrofizyoloji düzeneğinde bir mikroskop aşamasına yerleştirilir. Aşamalarımız sabittir ve dik yama kelepçeli mikroskobu, hareketli bir mikroskop platformuna veya bir mikroskop çeviricisine cıvatalanır.
2. Yama kelepçeli pipetler yatay bir çektirme üzerine çekilir (P-97; Sutter Enstrümanları A.Ş.) WPI'den elde edilen ince duvarlı, borosilikat camdan. Pipet ucu çapları, yangınla parlatmadan sonra pürüzsüz bir kenara kadar 0,2-0,4 μm mertebesindedir ve sap konikliği ~ 4 mm uzunluğundadır.
3. Pipeti amplifikatör kafasına takın.tage elektrofizyoloji kurulumunda. Baş aşamasını yatay eksene yaklaşık 45° açıda tutmak önemlidir, çünkü bu, pipet için Mauthner hücresi üzerinde yüksek dirençli contaların oluşturulması için uygun bir giriş açısı sağlar.
4. Banyo solüsyonuna girmeden hemen önce, ucun kirlenme olasılığını azaltmak için pipete az miktarda pozitif basınç uygulayın. mEPSC'leri kaydederken, banyo çözeltileri aksiyon potansiyellerini bloke etmek için 1 μM TTX, glisin reseptörlerini bloke etmek için 5 μM striknin ve GABAA reseptörlerini bloke etmek için 10 μM bikükülin veya 100 μM pikrotoksin içerir. mIPSC'leri kaydederken, banyo çözeltileri, ilgilenilen reseptör aktivitesine bağlı olarak 1 μM TTX, kinürenik asit ve bikükülin veya striknin içerir.
5. Pipette az miktarda pozitif basınçla M hücresine yaklaşın. Pozitif basınç, hücreyi nazikçe bir yandan diğer yana iter ve hemen hücrenin üzerine yerleştirildiğinde, hücre zarı üzerinde küçük bir çukur oluşturur. Pipet ile zar arasında güçlü bir sızdırmazlık oluşabilmesi için hücre yüzeyini nazikçe temizlemek için pipeti birkaç saniye yerinde bırakın. Pipetteki pozitif basıncın serbest bırakılması, contanın başlatılmasına izin verir ve negatif pipet potansiyelleri ile birleşen az miktarda negatif basınç, birkaç saniye içinde GigaΩ contaların oluşmasına neden olur.
6. Amplifikatör üzerindeki tutma potansiyelini -60 mV olarak değiştirin. Hücre zarını bir dizi kısa emme darbesi ile yırtın. Membran potansiyellerini hemen kaydedin ve kapasitans artefaktlarını en aza indirin. Hücre kapasitansını (Cm) ve erişim (seri) direncini (Ra)% 70-85 oranında telafi edin. Ra, her 30 saniye ila bir dakikada bir rutin olarak izlenmelidir ve% 20 veya daha fazla bir değişiklik varsa, deneyi iptal edin.
7. Deney sona erdikten ve yeterli veri elde edildikten sonra, arka beyin bir çift forseps ile çıkarılarak hazırlık feda edilir. Bu noktada veri analizine başlanabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Pipet Çektirme	Sutter Enstrümanlar A.Ş.	P-97
Dik Yama kelepçesi mikroskobu	Leica Mikro Sistemler	DMLFSA (Türkçe)
yükselteç	Moleküler Cihazlar	200 milyar
Mikromanipülatör	Siskiyou A.Ş.	MX7500