İntramüsküler (IM) Enjeksiyon: Yetişkin Bir Zebra Balığının Dorsal Kasına Bileşik Uygulama

Özet

Kaynak: Myllymäki, H., et al. DNA Bazlı Aşıların Klinik Öncesi Taraması için Yetişkin Zebra Balıklarının Bağışıklanması. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu videoda, yetişkin bir zebra balığının sırt kaslarına bileşikler vermek için kas içi enjeksiyon tekniği açıklanmaktadır.

Protokol

1. DNA Aşısının Enjeksiyonu ve Elektroporasyon

1. Bu protokole göre aşılama için sağlıklı, 6 ila 12 aylık yetişkin zebra balığı kullanın. Balıkları, 1 L su başına en fazla yedi balık olacak şekilde 14/10 saat aydınlık/karanlık döngüsüne sahip bir akış sisteminde tutun.
2. Balıkları uyuşturmak için tank suyunda %0.02 3-aminobenzoik asit etil ester (trikadam) çözeltisi (pH 7) hazırlayın. 10 cm'lik bir Petri kabı veya benzeri bir şey kullanın.
3. 5 L'lik bir kabı 3 L temiz sistem suyu ile doldurarak bir geri kazanım tankı hazırlayın.
4. Aşılama sırasında balığı sabit bir pozisyonda tutmak için bir aşı dolgusu hazırlayın. 2 ila 3 cm kalınlığında bir süngerden 5 x 7 cm² parça alın. Bir neşter bıçağı veya keskin bir makasla süngere bir oluk açın.
   not: Aynı aşı dolgusu birden fazla deneyde kullanılabilir. Deneyler arasında süngeri %70 etil alkole batırarak dezenfekte edin ve kurumaya bırakın.
5. Süngeri sistem suyuna iyice batırın ve süngeri bir Petri kabına yerleştirin.
6. Balıkları aşılamadan 24 saat önce oruç tutun.
7. Bir zebra balığını %0.02 tricaine içeren bir Petri kabına koyarak uyuşturun. Balık dokunma uyarımına cevap vermeyene ve solungaçlarda hareket etmeyene kadar bekleyin. Bir seferde tek bir balığı uyuşturun.
8. Plastik bir kaşık kullanarak, uyuşturulmuş zebra balığını ıslak süngerin üzerine aktarın ve balığın ventral tarafını oluğa yerleştirin. Doğru pozisyonda, balığın başının ve vücudunun çoğunun oluğun içinde olduğundan ve sırt yüzgeci ile kuyruğun oluktan dışarı çıktığından emin olun.
9. Mikroskop altında, mikromanipülatördeki x ve y ekseni ince ayar tekerleklerini kullanarak iğneyi zebra balığının sırt kasına yakın yaklaşık 45°'lik bir açıyla dikkatlice yerleştirin.
10. İğneyi itmenin kuvvet gerektirmediği sırt yüzgecinin önündeki pulsuz küçük noktayı bulun. Direnç hissedilirse, bitişik bir nokta deneyin. Omurgayı, sırt yüzgecini veya pulları yaralamaktan kaçının.
    not: İtme sırasında iğne bükülüyorsa, iğneyi keserek hafifçe kısaltın.
11. Aşı solüsyonunu kas içine kademeli olarak enjekte etmek için ayak pedalını kullanın. Enjeksiyonu mikroskopla gözlemleyin: fenol kırmızısı kas dokusuna girerken görülebilir. Gerekirse nabız süresini ayarlayın.
    not: Alternatif olarak, enjeksiyon için pnömatik pompanın ön panelindeki darbe başlatıcı düğmesini kullanın. Bununla birlikte, uzaktan kumandalı bir ayak pedalının kullanılması, 10 dönüşlü kadran tekerleği ile darbe uzunluğunu ayarlamak için diğer elin kullanılmasına izin verir. Solüsyonu çok hızlı enjekte etmekten kaçının, çünkü bu aşırı doku hasarına neden olabilir. Hava enjekte etmediğinizden emin olun.
12. Enjeksiyondan hemen sonra balığı elektriklendirin. Balığın hala anestezi altında olduğundan emin olun. Balıkları süngerin üzerinde tutun ve balıkları cımbız tipi elektrotlar arasına yerleştirin, böylece elektrotlar enjeksiyon bölgesinin her iki tarafına yerleştirilir. Elektrot cımbızını çok sıkı bastırmayın, her iki elektrotu da balıkla temas halinde tutun.
    1. Altı adet 40 V, 50 ms darbe vermek için elektroporatör üzerindeki başlat düğmesine basın.
    2. Balıkları yavaşça geri kazanım tankına aktarın.
    3. Her elektroporasyondan sonra elektrotları %70 etanol ile kaydırarak temizleyin.
       not: Aşılamadan sonra balığın refahını dikkatlice izleyin. Rahatsızlık belirtileri gösteren herhangi bir balığı (anesteziden yavaş iyileşme, anormal yüzme, nefes nefese kalma)% 0.04 tricaine içinde ötenazi yapın. İyileştikten sonra, balığı akış ünitesine aktarın ve normal şekilde besleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fenol kırmızı sodyum tuzu	Sigma-Aldrich	114537-5G
Trikain (etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu)	Sigma	A5040-100g	ANNESTEZİ VE ÖTENAZİ ÇÖZÜMÜ
Cımbız Elektrotları (7 mm) Kitleri	BTX Harvard cihazı	BTX 450165	Cımbız tipi elektrotlar
Alüminosilikat kılcal damarlar	Harvard aygıtı	30-0108
Mikromanipülatör	Narishige (Narishig)	MA-153
mikroskop	Olympus	ZS61
ECM Elektro Kare Poratör	BTX Harvard cihazı	BTX ECM 830
Plastik kaşık
sünger
Strafor çalışma tezgahı

Gazetesi Serisi Serisi Serisi