Embriyo Mikroenjeksiyonu: Zebra Balığı Sarısı İçine Bir Bileşik Verme Tekniği

Özet

Kaynak: Sorlien, E. L., et al. Danio rerio Model Sisteminde CRISPR/Cas9 Tarafından Üretilen Gen Nakavtlarının Verimli Üretimi ve Tanımlanması. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu videoda, bileşikleri Zebra balığı yumurta sarısı kesesine vermek için bir Embriyo mikroenjeksiyon tekniği açıklanmaktadır.

Protokol

1. CRISPR bileşenlerinin Zebra Balığı Embriyolarına Mikroenjeksiyonu

1. İstenen erkek ve dişi sayısını (tipik olarak 2 dişi ve 1 veya 2 erkek) bir bölücü ile bir üreme tankına yerleştirerek enjeksiyondan önceki gece üreme tankları kurun.
2. 35 mL eritilmiş agarozu 10 cm'lik bir Petri kabına dökerek %0,01 metilen mavisi (bir mantar ilacı) içeren 1x E3 ortamında (Malzeme Tablosuna bakınız) %1,5 agarozlu bir mikroenjeksiyon plakası hazırlayın ve çözeltiye kama şeklinde oluklar oluşturmak için plastik bir kalıp yerleştirin, hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak için kalıba hafifçe vurun.
3. Agarozun sertleşmesine izin verin ve tabağı az miktarda medya ile saklayın ve plakanın 4 °C'de kurumasını önlemek için parafin filme sarın.
   not: Enjeksiyon plakaları, kuyucuklar deforme olana veya kuruyana veya plaka küflenmeye başlayana kadar birkaç hafta boyunca tekrar kullanılabilir.
4. Enjekte edileceği sabah, saflaştırılmış sgRNA ve Cas9 proteinini buz üzerinde çözdürün. RNase kontaminasyonunu önlemek için tüm malzemeleri eldivenle tutmayı ve RNase içermeyen uçlar ve tüpler kullanmayı unutmayın.
5. 400 pg/nL Cas9 proteini ve 200 pg/nL sgRNA'nın nihai konsantrasyonlarını elde etmek için Cas9 proteini ve sgRNA'yı 2:1 Cas9:sgRNA oranında birleştirerek 5 μL'lik bir enjeksiyon çözeltisi oluşturun. Cas9 ve sgRNA'nın bir ribonükleoprotein kompleksi oluşturmasına izin vermek için Cas9/sgRNA çözeltisini oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. 0,5 μL ağırlıkça% 2,5 / hacimce fenol kırmızı çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 5 μL.
   'lik bir nihai hacme RNaz içermeyen su ekleyin not: Çözeltinin iyonik kuvvetinin Cas9/sgRNA kompleksinin çözünürlüğünü etkilediği gösterilmiştir, bu nedenle KCl ilavesi, düşük indel oluşumu sergileyen sgRNA'ların kesme verimliliğini artırabilir.
6. Mikropipet çektirme kullanarak 1.0 mm'lik bir cam kılcal damarı çekerek bir enjeksiyon iğnesi yapın. Yeni yapılmış iğnenin ucunu yeni bir tıraş bıçağı veya forseps kullanarak kesin ve koryon ve yumurta sarısı kesesini kolayca delecek açılı bir açıklık elde edin.
7. İğneyi, hava kaynağı açıkken bir mikroenjektöre bağlı bir mikromanipülatöre yerleştirin. Belirli bir aparat için belirlenen kalibrasyona uygun büyütmeyi kullanan bir ışık mikroskobu altında, iğne sürekli olarak 1 nL'lik bir çözeltiyi mineral yağ ile doldurulmuş bir Petri kabına çıkarana kadar enjeksiyon basıncını ayarlayın.
   not: İğnenin kalitesi çok önemlidir. Daha fazla deney yapmadan önce bir iğne üretme ve bu beceriye hakim olana kadar embriyoların yumurta sarısı kesesine enjekte etme alıştırması yapın.
8. Bölücüyü çıkarın ve balığın yaklaşık 15 dk.
   üremesine izin verin not: Daha uzun üreme süreleri daha fazla embriyo üretecektir, ancak Cas9 kesiminin erken gerçekleşme şansını en üst düzeye çıkarmak ve dolayısıyla genetik mozaikliği azaltmak için embriyolar 1 hücre aşamasındayken enjeksiyon tamamlanmalıdır. Embriyolar daha sonraki aşamalarda (2-4 hücre aşamaları) enjekte edilebilir, ancak bu muhtemelen modifiye alelin germ hattı iletim hızını azaltabilir.
9. Yumurtaları bir süzgeç kullanarak toplayın ve %0,0001 metilen mavisi içeren 1x E3 ortamı kullanarak 10 cm'lik bir Petri kabına durulayın. Yumurtaların sağlığını ışık mikroskobu altında inceleyin, döllenmemiş yumurtaları ve kalıntıları temizleyin.
10. 10-15 embriyoyu ayrı, etiketli bir Petri kabında enjekte edilmemiş bir kontrol olarak bir kenara koyun.
11. Bir transfer pipeti kullanarak, yumurtaları oda sıcaklığına ısıtılmış enjeksiyon plakasına nazikçe hizalayın.
12. 2.5X büyütmede bir diseksiyon mikroskobu altında, toplam 400 pg Cas9 proteini ve 200 pg sgRNA enjekte etmek için her embriyonun yolk kesesine 1 nL solüsyon enjekte edin.
    not: İstenirse veya gerekirse kesmeyi artırmak için, enjeksiyon çözeltisinde Cas9 proteininin nihai konsantrasyonunu 800 pg/nL'ye ve sgRNA'nın nihai konsantrasyonunu 400 pg/nL'ye yükseltin; Bununla birlikte, bu aynı zamanda hedef dışı kesimi artırabilir ve / veya embriyo sağlığını azaltabilir. Kesme verimliliği, doğrudan hücreye enjekte edilerek de arttırılabilir. Bununla birlikte, yumurta sarısı çuvalına enjeksiyon teknik olarak daha az zahmetlidir ve yüksek germ hattı iletimine sahip balık üretmek için yeterli kesim sağlar (modifiye edilmiş bir alel içeren yavruların% >70'i).
13. Enjekte edilen embriyoları uygun şekilde etiketlenmiş bir Petri kabına geri koyun, üzerlerini metilen mavisi içeren 1x E3 ortamı ile kaplayın ve 28 ° C'ye ayarlanmış bir embriyo inkübatöre koyun.
14. Döllenmeden 24 saat sonra (hpf), enjekte edilen embriyoların sağlığını inceleyin, ölü veya anormal şekilde gelişen bireyleri çıkarın ve ortamı değiştirin (Bkz. Şekil 1). Enjekte edilmemiş kontrole karşı hayatta kalma oranını kontrol edin.
    not: Gerekli olmayan bir geni hedeflerken, enjekte edilmemiş kontrole göre% 10'dan daha az ölümcüllük beklenir. Rehber enjekte edilen popülasyonlarda, enjekte edilmeyen kontrole kıyasla yüksek ölümcüllük seviyeleri gözlenirse, hedeflenen genin gelişim için gerekli olduğunu veya hedef dışı etkilerin başarısız gelişime yol açtığını gösterebilir. Enjekte edilen CRISPR reaktiflerinin miktarının azaltılması gerekebilir veya hedef dışı etkilerin azaltılmış olduğu yeni bir sgRNA'nın oluşturulması gerekebilir.
15. Embriyoları inkübatöre geri koyun ve embriyoları 72 hpf'ye büyütmeye devam edin, embriyo sağlığını korumak için ortamı günlük olarak değiştirin.

Sonuçlar

Şekil 1: 24 hpf enjekte edilen embriyonun sağlığının karşılaştırılması. 24 hpf'ye kadar geliştirilen canlı bir embriyo (A), gelişimi durdurulmuş bir embriyodan (B) kolayca ayırt edilebilir. (B)'ye benzeyen veya omurga eğriliği veya değişmiş baş ve göz gelişimi gibi (A)'ya büyük ölçüde değişmiş özelliklere sahip embriyolar tabaktan çıkarılmalıdır

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
RNaz içermeyen su	Herhangi bir marka		Kılavuz RNA'ların sentezi. Termo Fisher ve Qiagen'in her ikisi de taşıma uygun su.
E3 embriyo ortamı	Evde yapılan		Embriyo yetiştirme ortamı ve Enjeksiyon plakası yapımı. Tarif: http://cshprotocols.cshlp.org/ içeriği/2011/10/pdb.rec66449
Metilen Mavisi	Sigma-Aldrich	M9140	Embriyolarda mantar üremesini önlemek için 1x E3 ortamına eklenir.
Petri kabı	Termo Balıkçı	FB0875711Z	Embriyoları saklayın, enjeksiyon plakasını dökün
agaroz	Denville	CA3510-8	Döküm enjeksiyon plakası, agaroz jeller.
Mikroinksiyon kalıbı	Uyarlanabilir Bilim Araçları	TU-1	Enjeksiyon sırasında embriyoları tutmak için kuyular oluşturmak
Fenol Kırmızısı	Sigma-Aldrich	P0290 Serisi	Enjeksiyonun görselleştirilmesi için boya
Madeni Yağ	Sigma-Aldrich	M5904-5ML	İğne enjeksiyon hacmini kalibre etmek için.
Transfer pipetleri	Herhangi bir marka		Embriyoların taşınması
Tıraş bıçağı	Termo Balıkçı	11295-10	Kesme enjeksiyon iğnesi, kuyruk kırpma yetişkin balık.
kuvöz			Embriyoların 28.5 ° C'de tutulması.
Köşe pipet çektirmesi	David Kopf Enstrümanları	700C	Enjeksiyon için iğneler oluşturun. Ek iğne çekme talimatları: http:// cshprotocols.cshlp.org/ içeriği/2006/7/pdb.prot4651.long
Kılcal borular	Sutter Aletleri	BF100-58-10	Enjeksiyon için iğneler oluşturun.
Mikro yükleyici ipuçları	Eppendorf Belediyesi	930001007	Solüsyonu enjeksiyon iğnelerine yükleyin
Mikro enjektör	Dünya Hassas Aletler	PV 820	Embriyoların enjekte edilmesi.
Diseksiyon mikroskobu	Leica Belediyesi		Embriyoların enjekte edilmesi.
mikrodalga	Herhangi bir marka		Döküm enjeksiyon plakası, agaroz jeller.
ölçeklemek	Herhangi bir marka		Döküm enjeksiyon plakası, agaroz jeller.
eldivenler	Herhangi bir marka		Protokolün tüm yönleri için.
N2	Herhangi bir marka		Embriyo enjeksiyonu için kılcal damardan sıvıyı dışarı atmak için
PCR şerit tüpleri	Herhangi bir marka		Protokolün tüm yönleri için.
200 μL uçlar	Herhangi bir marka		Protokolün tüm yönleri için.
10 μL uçlar	Herhangi bir marka		Protokolün tüm yönleri için.
Mikropipetler	Herhangi bir marka		Protokolün tüm yönleri için.