Kalp Diseksiyonu: Zebra Balığı Kardiyak Gelişimini Gözlemlemek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Singleman C. ve diğerleri, larva, yavru ve yetişkin zebra balıklarında kalp diseksiyonu, Danio rerio. J. Vis. Uzm. (2011).

Bu videoda, kardiyak gelişim, olgunlaşma ve yaşlanmayı incelemek için birden fazla gelişim aşamasında kalbi bir zebra balığından izole etme tekniği açıklanmaktadır.

Protokol

1. Balıkların ölçülmesi ve diseksiyon

1. Tek balığı, yarısı taze PBS ile doldurulmuş petri kabına koyun ve sağ tarafına koyun.
2. Dijital mm kumpas kullanarak, kuyruk yüzgeçleri hariç, balığın burnundan kuyruğun tabanına (kuyruk sapı) kadar olan uzunluğunu ölçün (Şekil 1). Bu standart uzunluktur (SL).
3. Her balığa bir sayı/harf kombinasyonu atanabilir, böylece tek bir balık ve sonuçta ortaya çıkan disseke edilmiş kalbin daha sonra analiz edilmek üzere izlenmesine izin verilir. Ebeveyn stok numarası, fiksasyon yaşı, SL ölçümleri dahil olmak üzere veriler bir elektronik tabloya girildi ve bu etiketlere göre düzenlendi.
4. Diseksiyondan önce, PCR tüp şeritlerini atanmış takip numarasıyla etiketleyin ve daha fazla analiz için PBT veya uygun başka bir çözelti ile doldurun.
5. Vücudu forseps ile stabilize ederken balığın ventral tarafı petri kabında yukarı doğru yönlendirin ve başı gözler ve solungaçlar arasında tutun (Şekil 1).

Küçük balıklar (12 mm SL'den küçük):

1. a) Keskin forseps veya pim tutucusunda bir mikro iğne kullanarak, kalbi ortaya çıkarmak için göğüs kaslarını ve yüzgeçleri vücuttan çıkarın. Diseksiyon sırasında forsepslerin sürekli hareketi, PBT'de balığı hareket ettiren akımlara neden olabilir. Bu özellikle küçük balıklar için sorunludur, bu nedenle göğüs kaslarını ve yüzgeçlerini çıkarmak ve vücut boşluğunu açmak için bir mikro iğne kullanılabilir.
2. a) Kalbi atriyumun altından boşluktan çıkarmak için forsepsleri nazikçe kullanın. Alternatif olarak, bazı balıklarda soğanı nazikçe çekerek kalbi çıkarabilirsiniz ve kalbin geri kalanı bunu takip edecektir. Bu tekniği kullanıyorsanız atriyumun konumuna dikkat edin, çünkü kolayca zarar görebilir. Kalple birlikte gelen ekstra doku varsa, bu iyidir ve daha sonra temizlenebilir.
3. a) Balık, Tg(myl7:GFP)^twu34 gibi bir floresan kardiyak işaretleyici içeriyorsa, diseksiyon için floresan dürbün kullanın ve kalbin floresan ile çıkarıldığını doğrulayın (Şekil 2).
4. a) Kalp boşluktan çıkarıldıktan sonra, kalbi tutmak için forseps ve kalbin dışından ekstra kardiyak olmayan dokuyu ve epikardiyal astarı çıkarmak için bir mikro iğne kullanın.

Daha büyük balıklar (12 mm SL'den büyük):

6. b) Yaylı saplı mikro makas kullanarak 1 mm'den daha az derinlikte üç kesi yapın: 1- solungaçlardan enine kesim 2- ön göbekte enine kesim 3- her iki kesiği birbirine bağlayan ventral tarafta sagital kesim (Şekil 3).
7. b) Keskin forseps kullanarak göğüs kaslarını ve yüzgeçleri vücuttan çıkararak vücut boşluğunu açın ve perikardın gümüşi dokusunu ortaya çıkarın (Şekil 4A). Bu perikardiyal dokuyu çıkarın ve kalp görünür hale gelecektir (Şekil 4B).
8. b) Kalbin üstünde bulunan soğanlı arteriozusa bağlı arteri kesmek için mikro makas kullanın. Bu arter kesildikten sonra, forseps uçlarını atriyumun altına koyun, kalbi boşluktan çıkarmak için forseps kullanın. Kalple birlikte gelen ekstra doku varsa, bu sorun değil ve daha sonra çıkarılabilir.
9. b) Kalp boşluktan çıkarıldıktan sonra, kalbi tutmak ve fazla dokuyu çıkarmak için iki forseps veya kalbi tutmak için bir çift forseps ve fazla, kardiyak olmayan dokuyu çıkarmak için bir mikro iğne kullanın. Siyah pigmentasyonu ile belirgin olan epikardiyal astar, istenirse dokuyu nazikçe kazıyarak kalbin dışından çıkarılabilir.

Sonuçlar

Şekil 1.Balıkları forseps ile gözler ve solungaçlar arasında tutun.

Şekil 2.Burada gösterilen Tg(myl7:GFP)^twu34 gibi kardiyak spesifik bir floresan transgenik belirteç, daha küçük balıklardan kesilen kalplerin görselleştirilmesine yardımcı olabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Forseps #55	Güzel Bilim Araçları	11295-51
Mikro makas	Güzel Bilim Araçları	15005-08
Pim tutucu	Güzel Bilim Araçları	26016-12
Mikro iğneler	Güzel Bilim Araçları	10130-10
Petri kapları	BD Biyolojik Bilimler	351029