Zebra Balığı Beyin Diseksiyonu: Balık Nörobiyolojisi Tekniği

Özet

Kaynak: Lopez-Ramirez, M. A. ve diğerleri, Yetişkin Zebra Balığı Beyinden Elde Edilen Nörosferlerin İzolasyonu ve Kültürü. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu video, yetişkin bir zebra balığından beynin mikrodiseksiyon tekniğini anlatıyor. Bu yöntem, daha fazla çalışılabilecek tüm beyin kaynaklı nötrosferlerin elde edilmesine yardımcı olur.

Protokol

1. Yetişkin Zebra Balığı Beyninin Diseksiyonu

1. 100 mm x 15 mm'lik bir Petri kabını jel buz paketleri ile doldurarak bir diseksiyon yatağı hazırlayın. Ardından kapağı petri kabının üzerine yerleştirin ve jel donana kadar -20 °C'de inkübe edin. Kapağın üstüne bir kare temiz filtre kağıdı yerleştirin ve hem filtre kağıdını hem de petri kabını plastik filmle sarın.
2. Tüm mikrodiseksiyon aletlerini her kullanımdan önce %70 etanol veya ısı ile temizleyin ve sterilize edin. Tüm sterilize edilmiş diseksiyon aletlerini diseksiyon mikroskobunun yanına yerleştirin ve ötenaziden hemen önce diseksiyon yatağını fiber optik aydınlatmalı mikroskobun altına yerleştirin.
3. Bütün bir beyin nörosfer hazırlığı için 2 yetişkin zebra balığı toplayın; ve disseke beyin bölgelerinden nörosferler oluşturmak için 3 ila 4 zebra balığı.
4. Yetişkin zebra balıklarına (8-12 aylık) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan bir protokol kullanarak ötenazi yapın. Daha sonra, balığı 5-10 saniye boyunca% 75 etanole batırın ve hızlı bir şekilde diseksiyon yatağına yerleştirin ve ardından cerrahi bir bıçak kullanarak solungaç seviyesinde dekapitasyon yapın.
   1. Hayvanları ötenazi yapmak için, hayvanın kalp atışı yavaş yavaş yavaşlayana ve dolaşım durana kadar aşırı dozda (300 mg / L) trikasin metansülfonat uygulayın, ardından buzlu suya batırın.
5. Başın sırt tarafını aşağı çevirin ve makası kullanarak kesilen taraftan ağza uzunlamasına bir kesim yapın. Forseps kullanarak kafatasının tabanını açığa çıkarın ve tüm bitişik dokuyu çıkarın. Kafatasının yan duvarlarını omuriliğin başlangıcından tektuma doğru kesin.
6. Makası kullanarak, optik sinirleri kesin ve çıkarın ve ardından kafatasının en yan kısmının her iki tarafını da tektum seviyesinde çıkarın. Başın ventral tarafını yukarı çevirin. Forseps kullanarak, kafatasının en apikal kısmının geri kalanını soyun.
7. Beyni, kafatasının kalan kısmı ile birlikte diseksiyon ortamı (Penisilin / Streptomisin ile DMEM / F12) ile yeni bir tabağa aktarın. Mikro bıçağın plastik sapını kullanarak diseksiyon ortamındaki beyin dokusunu temizleyin ve tüm beyin yapılarını sağlam tutun.
8. Bu noktadan sonra, tüm zebra balığı beynini kullanarak protokole devam edin.
   1. Alternatif olarak, tüm zebra balığı beyninden veya taze bir neşter ile diseke edilen telensefalon, tektum / diensefalon veya beyincikten nörosferler oluşturmak için bu protokolü belirli beyin bölgelerine uyarlayın. Şekil 1'e göre ilgilenilen beyin bölgesini incelemek için nöral spesifik bir floresan zebra balığı nöral transgenik hattı kullanın.

Sonuçlar

Şekil 1: Zebra Balığı Beyin Kaynaklı Nörosferlerin Farklılaşması.(A-C, E) 1 (A, DiVd1), 3 (B, DiVd3) ve 4 (C ve D, DiVd4) gün boyunca Z-farklılaşma ortamında kültürlenen tüm beyin kaynaklı nörosferlerin faz kontrast görüntüleri. (E) 12 aylık bir Tg(GFAP:DsRed) zebra balığının tüm beyninin...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM/F12 1x	Yaşam Teknolojileri	11330-032
Penisilin-streptomisin	Yaşam Teknolojileri	15140-122
Trikain MS-222	Sigma	A5040	4 mg / ml'lik stok çözeltisi

Serisi