Ortotopik Enjeksiyon: Dokuya Özgü Kanser Hücrelerinin Yetişkin Bir Fareye İmplante Edilmesi

Özet

Kaynak: Katsuta, E., et al. Murin Ortotopik Metastatik Meme Kanseri Modeli Oluşturulması ve Murin Radikal Mastektomi Yapılması.J. Vis. Uzm.(2018).

Video, bir fare modelinde meme kanseri ortotopik aşılama tekniğini göstermektedir. Bu teknik, deri altı veya cerrahi olmayan enjeksiyona kıyasla tümör boyutu ve şeklinde daha az değişkenlik ile yüksek bir tümör oluşumu oranı üretir.

Protokol

1. Hücrelerin Hazırlanması (10 Fare İçin)

NOT: Hücre canlılığının azalmasını önlemek için hücreler çanaktan ayrıldıktan sonra 1 saat içinde aşılanmalıdır. Spesifik olarak, hücre süspansiyonu, canlılıklarını korumak için hücreleri tabaktan ayırdıktan sonra 15 dakika içinde jelatinimsi protein karışımına karıştırılmalıdır.

1. Lusiferaz eksprese eden bir fare meme adenokarsinomu hücre hattı olan 4T1-luc2 hücrelerinin, %5 CO₂ içinde 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde %10 FBS ile RPMI 1640 ortamında kültürlenmesi.
2. Yapışan 4T1-luc2 hücrelerini, 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak fosfat tamponlu salin (PBS) ile 10 cm'lik bir tabakta yıkayın. Bir P1000 pipeti kullanarak 1 mL %0,25 tripsin ekleyin ve ardından numuneyi 37 °C'de 5 dakika inkübe edin. Daha sonra, 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak 4 mL büyüme ortamı (% 10 FBS ile RPMI-1640) ekleyin ve hücre süspansiyonunu bir doku kültürü başlığındaki 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 180 x g'da santrifüjleyin.
3. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 2 mL PBS'de yeniden süspanse edin; Ardından, hemositometreyi kullanarak hücreleri sayın.
4. Doku kültürü başlığında 2 x 10⁶ 4T1-luc2 hücresini 40 μL soğuk PBS'de (pH 7.4, 4 ° C) askıya alın.
5. 40 μL hücre süspansiyonunu 360 μL jelatinimsi protein karışımı ile doku kültürü davlumbazındaki buz üzerinde 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde karıştırın.
   NOT: Nihai konsantrasyon 1 x 10⁵/20 μL'dir (1:9 PBS: jelatinimsi protein karışımı). Ortotopik model için (mastektomi yok), iki hafta içinde ötenazi kriterlerine (tümör boyutu > 2 cm) ulaşmasını önlemek için 1 x 10⁴/20 μL nihai konsantrasyon kullanıldı.

2. Kanser Hücresi Aşılaması

1. Fareleri sakin bir şekilde nefes alana kadar (2-3 dakika)% 2-4 izofluran ve 0.2 L / dk oksijen akışı ile anestezi indüksiyon odasına koyun.
2. Fareyi kavrayın ve omzuna deri altından 0.05 mg / kg buprenorfin enjekte edin.
3. Bir ayak parmağı tutamına reaksiyon olmaması nedeniyle yeterli anesteziyi onaylayın. Farenin burnunu, bir kömür tenekesi ünitesine bağlı %2-4 izofluran ve 2 L/dk oksijen akışı ile inhalasyon anestezisine izin veren fare maskesinin deliğine sokun
.
4. Laboratuvar bandı kullanarak farenin uzuvlarını kısıtlayın ve pamuklu çubuklar kullanarak klorheksidin, iyot ve %75 etanol kullanarak cildini sterilize edin.
5. Steril mikrodiseksiyon makası kullanarak ön göğüs duvarının ortasında 5 mm'lik bir cilt kesisi yapın, insizyonun yanındaki sağ taraftaki cildi kaldırın ve makası kullanarak cildi göğüs duvarından ayırın ve ardından sağ # 2 meme yağ pedini ortaya çıkarmak için cildi ters çevirin.
6. 28.5 G iğne ile 1 mL insülin şırıngası kullanarak 20 μL kanser hücresi süspansiyonunu, yaradan doğrudan görüş altında yağ yastığına dikkatlice enjekte edin.
   NOT: İğne deriden değil yaradan geçer. İğneyi dışarı çekmeden önce 5 saniye boyunca yağ pedinde tutmaya devam edin, bu da jelatinimsi protein karışımının katılaşması için zaman tanır.
7. Cilt kesilerini steril 5-0 emilmeyen dikişler kullanarak dikişle kapatın.
8. Ameliyattan sonra hayvanları temiz bir kafese koyun ve iyileşene ve serbestçe hareket edene kadar (~1-2 dakika sonra) izleyin. Bir hayvan ameliyattan sonraki 24 saat içinde sağlıklı görünmüyorsa, buprenorfin (0.2 mg / kg) uygulayın.
9. Ameliyattan 7 gün sonra anestezi altında dikişleri çıkarın (bkz. adım 2.1).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Mikro Diseksiyon Makası	Roboz Belediyesi	RS-5983	Kanser hücresi innokülasyonu ve mastektomi için
5-0 İpek Sütürler	bakmak	774B F
Roswell Park Anıt Enstitüsü 1640	Gibco (Gibco)	11875093	Hücre kültürü için
Fetal Sığır Serumu	Gibco (Gibco)	10437028	Hücre kültürü için
Tripsin-EDTA (% 0.25)	Gibco (Gibco)	25200056	Hücre kültürü için
Kuru sterilant (Germinator 500)	Braintree Bilimsel	GER 5287-120V	Kanser hücresi innokülasyonu ve mastektomi için
İğne Tutucu	Roboz Belediyesi	RS-7830	Kanser hücresi innokülasyonu ve mastektomi için
Adson Forseps	Roboz Belediyesi	RS-5233	Kanser hücresi innokülasyonu ve mastektomi için
Clipper	Ayhan	9908-717	Kanser hücresi innokülasyonu ve mastektomi için
Matrigel (Matrijel)	Corning	354234	Kanser hücresi innokülasyonu için

Serisi Serisi Serisi