Doğrudan Etkileşim ile 3D Ko-kültür: Etkileşimlerini İncelemek için Kanser Hücrelerini Monositlerle Birlikte Kültürlemek

Özet

Kaynak: Espinoza-Sánchez, et al. Hücre Dışı Matriks Ekstraktı (ECME) Tabanlı Üç Boyutlu Sistemde Monositler ve Primer Meme Kanseri Hücreleri Arasındaki İletişimin İncelenmesi. (2018).

Bu videoda, hücre dışı matris özütü (ECME) tabanlı bir ortamda etkileşimlerini incelemek için meme kanseri hücrelerinin monositlerle 3D ko-kültürü açıklanmaktadır. Bu yöntem, kollajen bozulması, bağışıklık hücresi alımı ve hücre istilası gibi belirli özelliklerin incelenmesine yardımcı olur.

Protokol

>1. 3D doğrudan etkileşim ile ortak kültürler

1. mRNA ve protein ekspresyonunun analizi için kültürden sonra her hücre soyunun bağımsız olarak sıralanmasına izin vermek için hücre kültüründen önce BrC hücrelerini ve monositleri farklı floresan boyalarla etiketleyin. Canlı hücrelerin hücre zarından serbestçe geçen, ticari olarak temin edilebilen kumarin ve rodamin türevlerini kullanın. Etiketleme için genel bir protokol aşağıdaki gibidir:
   1. İlgilenilen BrC hücrelerinin tek tabakasını hazırlayın (25 cm2'lik bir kültür şişesinde 2 × 10⁶ hücre) ve standart ortamı, floresan boyanın önceden ısıtılmış yeterli çalışma çözeltisiyle değiştirin (herhangi bir takviye olmaksızın standart baz ortamda floresan boyanın 1: 2.000'i). Nemlendirilmiş% 5 CO₂ ortamında 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Boya solüsyonunu aspire edin ve yeterli 1x PBS ile nazikçe durulayın. PBS'yi aspire edin ve standart ortamı ekleyin.
   2. Hücre tek tabakasını 37 ° C'de 5-10 dakika boyunca 2 mL% 0.05 tripsin ve 0.48 mM EDTA çözeltisi ile tripsinize edin. Tripsinizasyonu durdurmak için 200 μL FBS ve takviye olmadan 7 mL muhabir ortam ekleyin. Pipetleme ile hücreleri yeniden süspanse edin. Bir Neubauer odasındaki hücreleri saymak için 10 μL'lik bir alikot alın. Hücre sayımından sonra ko-kültür protokolüne devam edin.
   3. Hücreleri RT'de 5 dakika boyunca 430 x g'da pellet yapın (monositler süspansiyon halinde büyüdüğü için bunu önce gerçekleştirin). Süpernatanı atın ve hücreleri, 3 mL önceden ısıtılmış floresan boya çözeltisi (1: 2.000 floresan boya, takviyeler olmadan standart bir baz ortamda) ile nazikçe yeniden süspanse edin. Nemlendirilmiş% 5 CO₂ ortamında 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
   4. Hücreleri tekrar peletleyin, boya çalışma solüsyonunu atın ve 5-7 mL 1x PBS ile nazikçe yeniden süspanse edin. Bir kez daha pelet, PBS'yi atın ve hücreleri 5-7 mL standart ortamda yeniden süspanse edin. Bir Neubauer odasındaki hücreleri saymak için 10 μL'lik bir hücre süspansiyonu alikotu alın. Hücre sayımından sonra ko-kültür protokolüne devam edin.
2. Ko-kültürü aşağıdaki gibi ayarlayın: 4 oyuklu bir hazneli kızak sisteminin her bir oyuğunda eşit bir tabaka oluşturmak için kuyunun dibine yeterince ECME yayın. Plaka 20 μL, kuyucuk başına 5 × 10⁵ etiketli BrC hücresi içeren tek hücreli bir süspansiyon.
3. 37 ° C'de 15-20 dakikalık inkübasyondan sonra, 80 μL test ortamında (% 60 ECME ile desteklenmiş) 2.5 x 10⁵ etiketli monositten oluşan bir süspansiyon ekleyin.
4. ECME'nin 37 °C'de 15-20 dakika katılaşmasına izin verin.
5. BrC hücrelerinin ve monosit kültür ortamının 1: 1 karışımından 1 mL ekleyin.
6. Farklı zaman noktalarındaki değişiklikleri izlemek için ko-kültürleri nemlendirilmiş% 5 CO₂ ortamında 24 saat, 48 saat veya 5 gün boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
7. Kültürlerden hücreleri geri kazanmak için ECM proteinlerini bozun. Ortamı aspire edin ve atın,% 0.1 tripsin ve% 0.25 EDTA ile 0.5 mL 1x PBS ekleyin ve 37 ° C'de 3 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tripsini nötralize etmek için% 10 FBS ile 0.5 mL 1x PBS ekleyin ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için kuvvetlice pipetleyerek hücreleri yeniden süspanse edin.
8. RT'de 5 dakika boyunca 765 x g'da pelet hücreleri, süpernatanı atın ve hücreleri% 10 FBS ile 5 mL 1x PBS'de yeniden süspanse edin. Bu adımı bir kez tekrarlayın.
9. Hücre süspansiyonunu uygun aletle floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasına (FACS) tabi tutun. Nihai popülasyonların en az %95 saf olduğundan emin olun).
10. Ayırma işleminden sonra, hücreleri steril 1x PBS, pelet (RT'de 5 dakika boyunca 430 x g) ile yıkayın ve steril 1x PBS'de yeniden süspanse edin. Hücreler, RNA izolasyonu veya protein analizi için spesifik protokollere göre işlenebilir.
11. Kontrol olarak her bir hücre soyunun 3D kültürleri de dahil olmak üzere her testi üç kez tekrarlayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
U937	Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu ATCC	CRL-1593.2	Monositik hücre hattı / histiyositik lenfoma
THP-1	Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu ATCC	TİB-202	Monositik hücre hattı / akut monositik lösemi
MCF-10A Serisi	Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu ATCC	CRL-10317	Dönüştürülmemiş meme hücresi hattı
MCF-7	Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu ATCC	HTB-22	Meme Kanseri Hücre hattı
MDA-MB-231	Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu ATCC	HTB-26	Meme Kanseri Hücre hattı
RPMI 1640 orta	GIBCO BRL Yaşam Teknolojileri	11875-093
DMEM/F12	GIBCO BRL Yaşam Teknolojileri	11039-021
Antibiyotik/Antimikotik	GIBCO BRL Yaşam Teknolojileri	15240-062	100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin ve 0.25 μg/mL Mantar Zonu
Fetal Sığır Serumu	GIBCO BRL Yaşam Teknolojileri	16000-044
At serumu	GIBCO BRL Yaşam Teknolojileri	16050114
% 0.05 Tripsin-EDTA 1X	GIBCO BRL Yaşam Teknolojileri	25300-062
PBS 1X (Fosfat Tamponlu Tuzlu	GIBCO BRL Yaşam Teknolojileri	20012-027
Epidermal Büyüme Faktörü (EGF)	PeproTech Teknolojisi	AF-100-15 (1,00 mg)
Insülin	SIGMA-ALDRICH	I1882-100MG
Hidrokortizon	SIGMA-ALDRICH	H088-5G
Kolera toksini Vibrio cholerae	SIGMA-ALDRICH	C8052-1MG
Matrigel (Matrijel)	Corning A.Ş	356237	Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) fare sarkomu, hücre dışı matris özütü, 4 ° C'de kullanılana kadar -20 ° C'de saklayın
Lab-Tek hazneli kapaklı kaydırak (8 kuyulu)	Nalge Nunc Uluslararası	177402

Serisi (İngilizce) Teknolojisi Serisi Serisi Radarı Serisi Radarı Serisi Su Serisi Serisi .