zPDX-İnvazivlik Analizi: Zebra Balığı Embriyo Ksenogreftlerinde Metastatik Kanser Hücrelerinin İnvaziv Davranışının Araştırılması

Özet

Kaynak: Ren, J. et al. Embriyonik Zebra Balıklarında İnsan Meme Kanseri Hücrelerinin İnvaziv Davranışı. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu videoda, transgenik zebra balığı embriyolarının perivitellin boşluğuna meme kanseri hücresi verilmesi için bir mikroenjeksiyon yöntemi açıklanmaktadır. Kuluçkadan sonra, kanser hücresi istilasını, yayılmasını ve metastazı gözlemlemek için embriyoyu floresan mikroskop altında görselleştiriyoruz.

Protokol

1. Metastatik Süreci Görüntüleme ve Analiz Etme

1. Geniş uçlu bir Pasteur pipeti ile anestezi uygulanmış birkaç embriyoyu toplayın ve bunları bir polistiren kabın cam tabanına aktarın.
2. Fazla suyu alın ve sınırlı miktarda yumurta suyu bulundurun. Embriyoyu bir saç halkası aletiyle yerine manipüle edin ve camın üzerine bir kapak yerleştirin.
3. Suya daldırma veya uzun mesafeli kuru objektiflerle birlikte ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop kullanın. Embriyoyu, ilgilenilen bölge hedefe mümkün olduğunca yakın olacak şekilde konumlandırın.
4. Sıvı buharlaşmasına bağlı ölüm riskini azaltmak için anesteziden hemen sonra görüntüleme yapın.
   1. İki görüntüleme kanalını birleştirerek enjekte edilen hücreleri kan damarlarıyla birlikte kaydetmek için embriyolar üzerinde aynı konumda EGFP etiketli damar sistemi ve mCherry etiketli tümör hücrelerinden gelen sinyalleri yakalayın.
   2. Her zebra balığı embriyosu için, baş bölgesinden ve kuyruk bölgesinden iki farklı görüntü seti toplayın.
5. Yayılan hücrelerin sayısını ölçün.
   1. Perivitellin boşluk enjeksiyonları için, her balıkta hücre kütlesinden baş ve kuyruk bölgeleri içindeki embriyonik balık gövdesine doğru yayılan hücre sayısını sayın 4,15; bölgeler önden kalp boşluğunun sınırlarının ötesinde, dorsal olarak yüzme kesesinin üstünde ve kaudal olarak ürogenital açıklığın ötesindedir.
   2. Doc enjeksiyonu için, kuyruk yüzgecinin kollajen liflerini dolaşımdan istila eden tek tek hücrelerin sayısını (MDA-MB-231) veya her zebra balığının kaudal hematopoietik dokusunda (CHT) toplu olarak hücreler tarafından oluşturulan kümelerin sayısını (M2) sayın19.
6. Konfokal mikroskopi kullanarak invazyon ve metastazı daha ayrıntılı olarak inceleyin (şiddetle tavsiye edilir).
   1. Tüm vücudu görüntülemek ve tümör hücresi yayılma modeline genel bir bakış elde etmek için düşük büyütme (4X objektif) kullanın.
      NOT: Daha yüksek büyütme (20X ve 40X objektif), intra- ve peri-tümöral anjiyogenezi ve embriyo gövdesindeki yayılmış hücrelerin kesin lokalizasyonunu incelemek için uygundur.
   2. Zebra balığı embriyo damar sistemini taramak için 488 nm lazer ve kırmızı floresan ile etiketlenmiş implante edilmiş tümör hücrelerini taramak için 543 nm lazer kullanın. Her embriyoyu sekiz ila on adımda tarayarak yüksek kaliteli bir görüntü elde edin. Her adımı altı kez tarayın ve ortalamasını alın.
7. Daha fazla deney için gerekliyse, embriyoyu dikkatlice yumurta suyuna geri yerleştirin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Geniş uçlu Pastör pipeti (0,5-20 μL)	Eppendorf Belediyesi	F276456I
Konfokal mikroskop	Leica Belediyesi	SP5 STED
Stereo mikroskop	Leica Belediyesi	MZ16FA
Tg (fli:EGFP) zebra balığı türü			Nazikçe Dr. Ewa SnaarJagalska (Biyoloji Enstitüsü, Leiden Üniversitesi, Leiden, Hollanda) tarafından sağlanmıştır.
Cam tabanlı polistiren tabak	WillCo (WillCo)	GWST-5040
Floresan stereo mikroskop	Leica Belediyesi	M165 FC
Trikain (3-aminobenzoik asit)	Sigma Aldrich	A-5040

Serisi Serisi Serisi Serisi