Hücre Dışı Meme Yağ Pedleri: Meme Yağ Pedlerinden Hücre Dışı Matriks Hidrojellerinin Türetilmesi

Özet

Kaynak: Alves ve diğerleri, <a href="https://www.jove.com/v/59304/studying-normal-tissue-radiation-effects-using-extracellular-matrix">Hücre Dışı Matriks Hidrojelleri Kullanarak Normal Doku Radyasyon Etkilerinin İncelenmesi. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu videoda, in vitro çalışmalar için ex vivo ışınlamayı takiben murin meme yağ yastıkçıklarını hücreden arındırarak hücre dışı matris hidrojelleri türetme tekniği açıklanmaktadır. Bu hidrojel, tümör hücresi davranışını incelemek için radyasyon tedavisi sonrası in vivo meme dokusu ortamını taklit etmeye yardımcı olur.

Protokol

1. Hücresizleştirme

NOT: Bu prosedür, DNA'yı verimli bir şekilde uzaklaştırmak için sodyum dodesil sülfat yerine sodyum deoksikolat iyonik deterjanı içeren, adipoz hücre gidermeye odaklanan daha önce yayınlanmış yöntemlerden uyarlanmıştır.

1. 1. günde, donmuş Meme Yağ pedlerini veya MFP'leri -80 °C'den çıkarın ve oda sıcaklığında çözdürün.
2. Çözüldükten sonra, MFP'leri hassas bir görev mendilinde kısa bir süre kurulayın. MFP'leri analitik bir terazi kullanarak tartın.
3. Makas veya neşter ile bir çift forseps kullanarak, sağlam ECM'nin incelenmesi ve hidrojel üretimi için kalan dokunun incelenmesi için dokuyu 3 mm x 3 mm x 3 mm numunelere bölün.
   not: Numune sayısı, test yöntemlerinin sayısına bağlıdır, örneğin iki numunenin toplanması aşağıda açıklanmıştır: biri parafin gömme için (adım 1.5) ve istenirse kriyostat gömme ortamında dondurma için (bkz. Malzeme Tablosu ve adım 1.6).
4. Dokuları tartın. Kesit almak için parafin içine gömülüyorsa, adım 1.5'e geçin. Kesit alma için kriyostat gömme ortamında donuyorsanız, adım 1.6'ya devam edin.
5. Kimyasal bir başlıkta, dokuyu 4 ° C'de 24 saat boyunca% 10 nötr tamponlu formalin (NBF) (Malzeme Tablosuna bakınız) içine daldırın. Her biri 5 dakika boyunca PBS'de 3 kez yıkayın. Dokuyu 4 ° C'de 48 saat boyunca% 30 sükroz içine batırın.
   1. Bu parça çıkarıldığına göre dokuyu tartın. Adım 1.6'ya geçin.
6. Kimyasal bir başlıkta, MFP parçalarını kriyostat gömme ortamı ile hazırlanmış etiketli bir kasete yerleştirin. Dokuyu kaplamak için daha fazla kriyostat gömme ortamı ekleyin.
   1. Kaseti, sıvı nitrojen ile önceden soğutulmuş 2-metilbütanlı bir behere yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın). Beher, tabanı kaplamak için yeterli 2-metilbütana sahip olmalıdır, ancak kaseti batırmak için yeterli olmamalıdır, çünkü kriyostat gömme ortamı 2-metilbütana temas etmemelidir. Kriyostat gömme ortamı donana ve opak hale gelene kadar kaseti 2-metilbütan içinde bekletin.
   2. Kaset(ler)i folyoya sarın, etiketleyin ve kesitleme için kullanılana kadar -80 °C'de bırakın.
      not: Kriyostat gömme ortamına hemen yerleştirilen dokular 5 μm'de kesitlere ayrılırken, sükroz içinde inkübe edilen dokular adiposit morfolojisini korumak için 30 μm'de kesitlere ayrıldı.
7. Kalan dokuya manuel olarak masaj yapmak için forseps kullanın.
   not: Doku parçaları ayrıca 24-48 saat boyunca% 10 NBF'ye yerleştirilebilir, PBS'de durulanabilir ve parafine gömülene kadar% 70 etanol içinde bırakılabilir. Gömmeyi takiben, hematoksilen ve eozin (H & E) boyama için 5 μm'lik kesitler kullanılabilir (aşağıdaki bölüm 2'ye bakınız).
8. MFP'leri 5 mL% 0.02 tripsin /% 0.05 EDTA çözeltisi içeren 6 cm'lik tabaklara yerleştirin. 37 °C'de 1 saat inkübe edin. İnkübatöre yerleştirmeden önce bulaşıkları% 70 etanol ile püskürtün ve silin.
9. MFP'leri deiyonize (DI) su ile yıkamak için 0,7 mm'lik süzgeçler kullanın ve dokunun üzerine üç kez su dökün. Yıkamalar arasında dokuya manuel olarak masaj yapmak için forseps kullanın.
10. Hassas bir görevde kısa bir süre kuru doku, silin ve tartın. Dokuları, uygun boyutta bir karıştırma çubuğu içeren önceden otoklavlanmış bir behere yerleştirin. Dokuları 1 g doku başına 60 mL% 3 t-oktilfenoksipolietoksietanol (Malzeme Tablosuna bakınız) ile kaplayın ve oda sıcaklığında 1 saat karıştırın. En az 20 mL kullanın.
11. Doku ve içindekileri bir süzgecin içine boşaltın. Beheri DI su ile durulayın ve dokuların üzerine dökün. İki kez daha tekrarlayın. Durulamalar arasında dokuya manuel olarak masaj yapmak için forseps kullanın.
12. Hassas bir görevde kısa bir süre kuru doku, silin ve tartın. Mendilleri ve karıştırma çubuklarını aynı beherlere geri yerleştirin ve 1 g doku başına 60 mL% 4 deoksikolik asit ile kaplayın. Oda sıcaklığında 1 saat karıştırın. En az 20 mL kullanın.
13. Doku ve içindekileri bir süzgeç içine boşaltın. Beheri DI su ile durulayın ve dokuların üzerine dökün. İki kez daha tekrarlayın. Durulamalar arasında dokuya manuel olarak masaj yapmak için forseps kullanın.
14. Hassas bir görevde kısa bir süre kuru doku, silin ve tartın.
15. Dokuları% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş taze DI su ile aynı behere yerleştirin. Parafin film ile sıkıca örtün. Gece boyunca 4 °C'de bırakın.
16. Süzgeçleri ve beherleri ertesi gün kullanmak üzere yıkayın.
17. 2. günde, beher içeriğini bir süzgecin içine boşaltın. Hassas bir görevde kısa bir süre kuru doku, silin ve tartın.
18. MFP'leri uygun boyutta bir karıştırma çubuğu ile aynı behere yerleştirin. 1 g doku başına 60 mL% 4 etanol/% 0.1 perasetik asit çözeltisi ile kaplayın. En az 20 mL kullanın. Oda sıcaklığında 2 saat karıştırın.
19. Mendil ve içindekileri 0,7 mm'lik bir süzgecin içine boşaltın. Dokuya manuel olarak masaj yapmak için forseps kullanın. İçeriği tekrar behere yerleştirin. Dokuyu 1 g doku başına 60 mL 1x PBS ile kaplayarak yıkayın. En az 20 mL kullanın. Oda sıcaklığında 15 dakika karıştırın. Bir kez tekrarlayın.
20. Mendil ve içindekileri 0,7 mm'lik bir süzgecin içine boşaltın. Dokuya manuel olarak masaj yapmak için forseps kullanın. İçeriği tekrar behere yerleştirin. Dokuyu 1 g doku başına 60 mL DI su ile kaplayarak yıkayın. En az 20 mL kullanın. Oda sıcaklığında 15 dakika karıştırın. Bir kez tekrarlayın.
21. Hassas bir görevde kısa bir süre kuru doku, silin ve tartın. Doku ve içindekileri bir süzgecin içine boşaltın. Dokuya manuel olarak masaj yapmak için forseps kullanın.
22. İçeriği tekrar behere yerleştirin. Dokuları 1 g doku başına 60 mL% 100 n-propanol ile örtün. En az 20 mL kullanın. Oda sıcaklığında 1 saat karıştırın.
23. Hassas bir görevde kısa bir süre kuru doku, silin ve tartın. Mendil ve içindekileri 0,7 mm'lik bir süzgecin içine boşaltın. Dokuya manuel olarak masaj yapmak için forseps kullanın.
24. İçeriği tekrar behere yerleştirin. Dokuyu 1 g doku başına 60 mL DI su ile kaplayarak yıkayın. En az 20 mL kullanın. Oda sıcaklığında 15 dakika karıştırın. Üç kez tekrarlayın.
25. Doku ve içindekileri bir süzgecin içine boşaltın. Sükroz inkübasyonu ve kriyostat gömme ortamında dondurma için doku parçalarını toplamak için 2.3–2.6 adımlarını tekrarlayın.
26. Hassas bir görevde kısa bir süre kuru doku, silin ve tartın. Etiketli 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Gece boyunca -80 °C'de dondurun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 10 Nötr Tamponlu Formalin, Tıkaçlı Küp	VWR (VWR)	16004-128
2-metilbütan	Alfa Aesar	19387
Sığır Serumu Albümini	Sigma-Aldrich	A1933-25G
Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu suyu	Gibco (Gibco)	14040133
Fisher Healthcare Doku Artı OCT Bileşiği	Balıkçı Bilimsel	23-730-571	kriyostat gömme ortamı
Kimtech Bilim Kimwipes	Kimberly Clark'ın fotoğrafı		Hassas görev silmeleri
n-Propanol (Peroksit İçermez / Dizileme), Fisher BioReaktifler	Balıkçı Bilimsel	BP1130-500
PBS (10X), pH 7.4	Kalite Biyolojik, Inc.	119-069-151	Fosfat tamponlu tuzlu su
Penisilin-Streptomisin	Gibco (Gibco)	15140-122
Perasetik asit	Sigma-Aldrich	77240-100 ML
Triton x-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML	t-Oktilfenoksipolietoksietanol
Tripsin-EDTA (% 0.25), fenol kırmızısı	Gibco (Gibco)	25200-056
Richard-Allan Bilimsel İmza Serisi Hematoksilen 7211	Richard-Allan Bilimsel	7211
Whatman kalitatif filtre kağıdı, Sınıf 4	Ne adam	1004-110	4. Sınıf Kalitatif Filtre Kağıdı
Ksilen (Sertifikalı ACS), Fisher Kimyasal	Balıkçı Bilimsel	X5-5