Doz Yükseltme: Kanser Hücrelerinde İlaç Direnci Geliştirmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Yamaoka T. ve ark., Afatinib Dozlarının Artırılmasıyla Geliştirilen Üç Afatinib Dirençli Akciğer Adenokarsinomu PC-9 Hücre Hattının Oluşturulması ve Karakterizasyonu. J. Vis. Uzm., 2019

Video, daha önce MTT testi ile ilacın IC₅₀ değerlerini hesapladıktan sonra hücreleri bir ilacın artan dozlarına maruz bırakarak kanser hücrelerinde ilaç direncinin gelişimini açıklar. Örnek protokol, ilaca dirençli hücrelerin geliştirilmesinin adım adım sürecini açıklar.

Protokol

1. Afatinib'e Dayanıklı Üç Bağımsız PC-9 Hücre Hattının Kurulması

1. 3- (4,5-dimetiltiyazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) testi kullanılarak PC-9 hücreleri için ilk afatinib maruziyet konsantrasyonunun belirlenmesi.
   1. Fetal sığır serumu (% 10), penisilin (100 U / mL) ve streptomisin (100 μg / mL) içeren büyüme ortamında PC-9 hücrelerini, 37 ° C'de% 5 CO₂ inkübatörde 10 cm'lik bir hücre kültürü ile muamele edilmiş bir tabakta kültürleyin.
   2. PC-9 hücrelerini büyüme ortamında 4 x 10⁴ hücre / mL'de yeniden süspanse edin ve daha sonra 96 oyuklu bir mikroplakada 50 μL / kuyuda tohumlayın. Hücrelerin nihai konsantrasyonu 2.0 x 10³ hücre / 50 μL / kuyudur. 37 ° C'de% 5 CO₂ inkübatörde gece boyunca inkübe edin.
   3. Farklı konsantrasyonlarda 50 μL afatinib çözeltisi ekleyin: 0, 0.002, 0.006, 0.02, 0.06, 0.2, 0.6, 2, 6 ve 20 μM, büyüme ortamını (50 μL) içeren kuyucuklara. Afatinib'in nihai hacmi ve konsantrasyonları sırasıyla 100 μL ve 0, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3 ve 10 μM'dir.
   4. 96 oyuklu plakayı 37 ° C'de% 5 CO₂ inkübatörde 96 saat inkübe edin.
   5. Her bir oyuğa 15 μL boya çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve 37 ° C'de% 5 CO₂ inkübatörde 4 saat inkübe edin ve daha sonra 100 μL çözündürme / durdurma çözeltisi ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) her bir oyuğa ve gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO₂ inkübatörde inkübe edin.
   6. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak optik yoğunluğu 570 nm'de (OD₅₇₀) ölçün (bkz. Malzeme Tablosu). 6-12 kopya hazırlayın ve deneyleri en az üç kez tekrarlayın.
   7. Bu verileri yarı log grafik olarak grafiksel olarak çizmek ve yanıtı maksimumunun %_50'sine düşüren ilaç konsantrasyonu olan IC 50 değerini hesaplamak için istatistiksel yazılım (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın (bkz. Malzeme Tablosu).
2. PC-9 hücrelerinin, üç bağımsız 10 cm'lik tabakta kademeli doz artışı ile geri dönüşü olmayan EGFR-TKI, afatinib'e sürekli maruz kalması
   1. 10 mL büyüme ortamı içeren p100 kaplarında PC-9 hücrelerini kültürleyin. PC-9 hücreleri alt birleşim aşamasına ulaştığında, 1 mL hücre süspansiyonunu 9 mL büyüme ortamı ile üç yeni p100 kabına aktarın. 1:10 seyreltilmiş PC-9 hücreleri, yaklaşık 4-5 x 10⁵ hücre / mL'lik bir hücre sayısı ile 3-4 gün içinde alt birleşim haline gelir.
   2. Ertesi gün, üç p100 kabının her birine IC₅₀ afatinib değerinin 1/10'unu ekleyin.
      NOT: Afatinib, DMSO'da 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1 mM ve 5 mM stok konsantrasyonlarında sulandırılır. 1 ila 10 μL afatinib çözeltisi, gerekli nihai konsantrasyonlara göre kültürdeki 10 mL büyüme ortamına eklenir.
   3. Afatinib içeren p100 kaplarındaki hücreler alt birleşim haline geldiğinde, 1 mL'lik bir pipetle aspirasyon yoluyla iyice karıştırın ve yeni bir p100 kabında 9 mL taze büyüme ortamına 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin. Daha sonra, yeni kültüre% 10-20 daha yüksek konsantrasyonlarda afatinib ekleyin.
   4. 10-12 aylık süre boyunca her adımda% 10-20 oranında artan afatinib konsantrasyonu ile kademeli doz artışı ile ortamda 0.1 nM ila 1 μM afatinib konsantrasyonunu arttırın.
      not: Afatinib konsantrasyonu IC₅₀ değerine yaklaştığında hücre büyümesi oldukça yavaşlar. Hücreler 1:9 oranında bölünürse, bu hücreler daha yüksek konsantrasyonlarda afatinib tarafından öldürüldüğü için büyümeyebilirler. Bu nedenle, daha yüksek afanitib konsantrasyonlarında, hücreler 1: 2 oranında bölünebilir. En dirençli hücreler afatinib içeren besiyerinde 3-14 gün boyunca büyütüldü ve besiyeri, dirençli hücrelerin geçmesi gerekene kadar değiştirilmedi.
   5. Afatinib dirençli hücreleri 1 μM afatinib içeren büyüme ortamında 2-3 ay boyunca kültürleyin. 1 μM'lik bir afatinib konsantrasyonunda, bu modelde afatinib'e direnç geliştirmek için 10-12 ay gereklidir. Hücrelerin afatinib'e dirençli olduğunu doğrulamak için MTT testini gerçekleştirin. Bağımsız olarak kurulan üç afatinib direnç hücre hattı AFR1, AFR2 ve AFR3 olarak adlandırıldı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
FBS (FBS)	Gibco Şirketi	26140-079
Kalem Strep	Gibco Şirketi	15140-163
Hücre kültürü ile işlenmiş 10 cm'lik tabak	Viyola	2-8590-03
Afatinib	Selleck Belediyesi	S1011 Serisi
96 kuyulu mikroplaka	Termo	130188
Hücre Titresi 96	Promega	G4100	Radyoaktif Olmayan Hücre Proliferasyon Testi; Boya çözeltisi ve Çözündürme / Durdurma çözeltisi
NanoDrop Lite spektrofotometre	Termo	Na	Spektrofotometre
GraphPad Prism v.7 yazılımı	GraphPad, Inc.	Na	bir istatistik yazılımı
DMSO (Türkçe)	Wako (Vahşi)	043-07216