Koloni Oluşumu Deneyi: Antikanser Ajanların Koloni Oluşturan Akciğer Kanseri Hücreleri Üzerindeki Etkinliğinin Değerlendirilmesi

Özet

Kaynak: Lee, J. Y.et al, Antikanser Kumarin OT48'in Biyoaktivitesinin Sferoidler, Koloni Oluşum Testleri ve Zebra Balığı Ksenogreftleri ile Klinik Öncesi Değerlendirmesi.J. Vis. Uzm. (2018).

Bu videoda, akciğer kanseri hücrelerinin süresiz olarak çoğalma ve bireysel koloniler oluşturma yeteneğini belirlemeye yardımcı olan koloni oluşumu testi açıklanmaktadır. Bir antikanser ajanının koloni oluşturan hücreler üzerindeki etkisini, ortaya çıkan kolonilerin sayısındaki ve/veya boyutundaki değişiklikleri analiz ederek analiz edebiliriz.

Protokol

1. Koloni Oluşumu Deneyleri

1. 37 ° C'de bir CO₂ inkübatöründe 75^cm2'lik bir şişede% 10 FBS (Fetal Sığır Serumu) ve% 1 antibiyotik ile desteklenmiş 15 mL RPMI1640 hücre kültürü ortamında 20.000 hücre / cm 2 konsantrasyonunda A549 hücrelerinin kültürü ve% 5 CO₂.
2. Deney gününde, bir hemositometre kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin. 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 7 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleme ile 50.000 hücre toplayın ve hücreleri 1.5 mL tüplerde 100 μL 1x steril PBS (Fosfat Tamponlu Salin) içinde yeniden süspanse edin.
3. 1.1 mL yarı katı metilselüloz bazlı ortamı (MCBM) 15 mL'lik tüplere multipipet ile dağıtın. Her koşul için bir tüp hazırlayın.
4. Bir P200 mikropipet kullanarak 1,1 mL MCBM'ye 110 μL FBS ekleyin.
5. Hücreleri 1.000 hücre / mL'de tohumlar. Bir P2 mikropipet kullanarak stok çözeltisinden (100 μL 1x PBS'de 50.000 hücre) 2,4 μL hücre süspansiyonu toplayın ve %10 FBS ile desteklenmiş 1,1 mL MCBM'ye ekleyin.
6. Hücreleri ekledikten sonra, tüpleri 1 dakika boyunca vorteksleyin, MCBM ve hücreleri iyi bir şekilde karıştırmak için en yüksek hızda dikey olarak tutun.
7. Test bileşikleri ekleyin (OT48 tek başına veya A1210477 ile kombinasyon halinde). Kullanılan çözücü için kontrol olarak ayrı bir tüp hazırlayın (burada dimetil sülfoksit (DMSO)). Bileşiklerin konsantrasyonuna ve her bir koşul için eklenen hacme bağlı olarak, çözücü kontrolü, çözücünün neden olduğu olumsuz etkileri değerlendirmek için test bileşiğinin seyreltmeleri için kullanılan en yüksek çözücü konsantrasyonunu içerecektir.
8. Tüpleri 1 dakika boyunca girdaplayın.
9. Her tahlil için, 12 oyuklu bir hücre kültürü plakasının merkez kuyucuğuna bir P1000 mikropipet ile 1 mL karışım ekleyin.
10. Nemi stabilize etmek için boş kuyuları 1 mL steril su veya 1x PBS ile doldurun.
11. Kültür plakalarını 37 ° C ve% 5 CO_2'de bir inkübatörde 10 gün boyunca inkübe edin
12. 10 günlük inkübasyondan sonra, 1 mg / mL'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için her bir oyuğa 200 μL bir MTT (metiltiyazildifenil-tetrazolyum bromür) stok çözeltisi (5 mg / mL) ekleyin.
13. 37 ° C ve% 5 CO_2'de bir inkübatörde 10 dakika inkübe edin. Canlı koloniler menekşe rengine dönecektir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
A549	ATCC (Uzay Servisi)	CCL-185	37 C°
dev/dak 1640	Fransa	30096	4 C°
FBS (FBS)	Biyobatı	S1520-500 Serisi	-20 C°
Penisilin-Streptomisin	Fransa	17-602E	-20 C°
Hücre kültürü şişesi T75	Spl	70075	Rt
PBS çözümü	Klon	SH30256.02	Rt
1.5ml tüp	Ekstra gen	Tüp-170-C	Rt
15 ml tüp	Hyundai Mikro	H20015	Rt
12 oyuklu plaka	Spl	30012	Rt
Yöntem Kültü	Kök Hücre teknolojileri	4230	-20 C°
Tiazolil Mavi Tetrazolyum Bromür (MTT tozu)	Sigma	M5622	4 C°
LAS4000	GE Sağlık Teknolojileri		Rt

Serisi Serisi Serisi Serisi