Zebra Balığı Ksenogreft Testi: Zebra Balığı İn Vivo Tedavisinde Terapötiklerin Tümörojenite Üzerine Anti-kanser Etkinliğini Değerlendirmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Lee, J. Y ve diğerleri,Antikanser Kumarin OT48'in Biyoaktivitesinin Sferoidler, Koloni Oluşum Deneyleri ve Zebra Balığı Ksenogreftleri ile Klinik Öncesi Değerlendirmesi.J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, in vivo tümör oluşumunu değerlendirmek ve terapötik ajanların etkisini incelemek için zebra balığı ksenogreft testi açıklanmaktadır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Zebra Balığı Ksenogreft Testi

NOT: Bu teknik yaklaşım bir şematik olarak görselleştirilmiştir (Şekil 1).

1. Stok reaktiflerinin hazırlanması
   1. 1 L 30x Danieau çözeltisi hazırlayın: 1740 mM NaCl, 21 mM KCl, 12 mM MgSO₄•7H2O, 18 mM Ca(NO₃)₂ ve 150 mM HEPES. Bir pH metre kullanarak tamponun pH'ını 7,6'ya ayarlayın.
   2. % 1 (50x) trikain çözeltisi hazırlayın: 20 mg etil 3-aminobenzoat metansülfonatı (trican) 2 mL damıtılmış suda çözün.
   3. % 1 fenol Kırmızı-PBS çözeltisi hazırlayın: 1.5 μL'lik bir tüpte 198 μL sterilize PBS çözeltisine 2 μL Fenol Kırmızı sodyum tuzu çözeltisi ekleyin.
   4. % 3 metilselüloz hazırlayın: 100 mL 1x Danieau çözeltisine 3 g metilselüloz ekleyin.
2. Zebra balığı yumurtası üretimi ve kuluçka
   1. Karanlıkta 28,5 °C'de UV ile sterilize edilmiş ve filtrelenmiş musluk suyuyla doldurulmuş bir bölme tankında bir dişi ve bir erkek zebra balığını ayırın. 24 saatlik ayrılmadan sonra, çiftleşmeyi başlatmak için her iki cinsiyetten balıkları karıştırın. Döllenmiş yumurtaları çiftleşme tankından 5 mL taze Danieau çözeltisi içeren bir Petri kabına aktarın.
   2. Yumurtaları 5 mL Danieau solüsyonu ile üç kez yıkayın. Yıkama için, yumurtaları bir pipetle dikkatlice aspire edin ve 5 mL taze çözeltiye aktarın. 28.5 °C'de 8 saat inkübe edin.
      1. Danieau'nun çözeltisinde 8 saatlik inkübasyondan sonra, pigmentasyonu inhibe etmek için Danieau'nun% 0.03 1-fenil-2-tiyoüre (PTU) içeren çözeltisine geçin. Kontaminasyonu önlemek için opak yumurtaları (döllenmemiş veya gelişmemiş embriyolar içeren) ayırın.
3. Embriyo dekoryonasyonu
   1. Döllenmeden 24 saat sonra (HPF), zebra balığı embriyolarını keskin forseps kullanarak dekoryonlayın. Kuluçkalık embriyoları Danieau'nun solüsyonunda 28.5 ° C'de% 0.03 PTU ile 48 hpf'ye kadar inkübe edin.
4. Bileşikle işlenmiş hücre hazırlığı
   1. 25 cm2 kültür şişesinde 20.000 hücre / cm2'de A549 hücrelerini tohumlayın. 24 saatlik tohumlamadan sonra, 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de bir inkübatörde 24 saat boyunca bileşikler (burada 50 μM'de OT48 ve / veya 20 μM'de A1210477) ekleyin.
   2. Hücrelerin canlılığını korumak, ancak onları hücre ölümüne doğru işlemek için her bileşik için tedavi süresini ayarlayın. Bu zaman noktasının, hücre canlılığı, morfolojisi ve moleküler belirteçlere dayalı olarak ayrı ayrı ayarlanması gerekir.
   3. Tedavinin bitiminden 2 saat önce, hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de 4 μM floresan hücre izleyici boyası CM-Dil ile boyayın. 2 saatlik inkübasyondan sonra, hücreleri% 0.05 tripsin-EDTA ile tripnize edin ve enjeksiyondan önce 106 hücreyi 50 μL fenol Red-PBS çözeltisi içinde seyreltin.
5. Ksenogreft oluşumu için kanser hücrelerinin mikro enjeksiyonu
   1. Zebra balıklarını bir agar tabağına yerleşene kadar 5 dakika boyunca% 0.02'lik bir tricaine solüsyonunda uyuşturun.
   2. 1.0 mm'lik (dış çap (OD) cam kılcal) bir mikropipet çekiciyle çekin (Program ayarları: P: 300, Isı: 260, Çekme: 60, VEL: 50 ve Süre: 200). Keskin bir kenar oluşturmak için mikrokılcal damarı bir şırınga ile kesin. Mikrokılcal damarları 20 μL hücre / fenol Red-PBS çözeltisi ile yükleyin. Enjeksiyon başına 2 nL dağıtmak için enjeksiyon basıncını ve süresini ayarlayın.
   3. 3 ila 5 enjeksiyon yoluyla 6 ila 10 nL enjekte ederek yumurta sarısı kesesine 100-200 hücre enjekte edin. Enjeksiyondan sonra, balığın PTU çözeltisi içeren 5 mL taze Danieau çözeltisinde 10 ila 30 dakika iyileşmesine izin verin. Balıkları 1 mL Danieau'nun PTU çözeltisi içeren çözeltisi ile 24 oyuklu plakalara gönderin ve 28.5 ° C'de 72 saat inkübe edin.
   4. 72 saatlik inkübasyondan sonra, balıkları% 0.02'lik bir tricaine çözeltisinde uyuşturun ve% 3'lük bir metilselüloz damlası ile bir cam slayt üzerinde hareketsiz hale getirin. Floresan mikroskobu ile 620 ila 750 nm dalga boyunda 5x fotoğraf çekin.
   5. ImageJ yazılımı ile floresan tümörlerin boyutunu ölçün. Menüyü seçin "Analiz | Ölçün". Floresan sinyale karşılık gelen değerleri kaydedin ve grafiksel gösterim için bir istatistik yazılımı ile analiz edin.

Sonuçlar

Şekil 1: Zebra balığı ksenogreft testinin genel sürecinin şematik diyagramı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
A549	ATCC (Uzay Servisi)	CCL-185	37 C°
dev/dak 1640	Fransa	30096	4 C°
FBS (FBS)	Biyobatı	S1520-500 Serisi	-20 C°
Penisilin-streptomisin	Fransa	17-602E	-20 C°
Hücre kültürü şişesi T25	Spl	70025	Rt
Hücre kültürü şişesi T75	Spl	70075	Rt
Hücre kültürü şişesi T175	Spl	71175	Rt
1.5ml tüp	Ekstra gen	Tüp-170-C	Rt
24 kuyulu plaka	Spl	30024	Rt
Petridiş	Spl	10100	Rt
PBS çözümü	Klon	SH30256.02	Rt
Tripsin-EDTA	Gibco (Gibco)	25-300-054	4 C°
Sodyum Klorür	Sigma-Aldrich	71382	Rt
Potasyum klorür (KCL)	Sigma-Aldrich	P9541 Serisi	Rt
Magnezyum sülfat heptahidrat (MgSO4.7H2O)	Sigma-Aldrich	M2773 Serisi	Rt
Kalsiyum nitrat tetrahidrat (Ca(NO3)2)	Sigma-Aldrich	C1396	Rt
HEPES çözümü	Sigma-Aldrich	H0887	Rt
Etil 3-aminobenzoat metansülfonat (Trikain)	Sigma-Aldrich	E10521	Rt
Fenol Kırmızısı çözeltisi	Sigma-Aldrich	P0290 Serisi	Rt
Metilselüloz	Sigma-Aldrich	M0512	Rt
1-fenil-2-tiyoüre (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629 Serisi	Rt
CM-Dil boyası	Canlandırıcı	C7001	-20 C°
Cam kılcal damar	Dünya Hassas Aletler	TW 100F-4	Rt
Mikropipet çektirme	Deklanşör aleti, ABD	P-97	Rt
Mikro enjektör	Dünya Hassas Aletler	PV820	Rt
şırınga	KOVAX BELEDIYESI	1 ml	Rt
Mikro yükleyici	Eppendorf Belediyesi	5242956003	Rt
Cam kaydırak	Marienfeld	HSU-1000612	Rt
Floresan mikroskobu	Leica Belediyesi	DE/DM 5000B	Rt

Serisi Serisi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Serisi Uçağı Serisi Belediyesi Serisi